星形膠質(zhì)細胞通過Cx43參與ATP介導的小膠質(zhì)細胞活化的研究.pdf

1、目的：利用雙光子顯微鏡和綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠在體觀察細胞活動的優(yōu)勢,以顱腦開窗和離體腦組織切片兩種方法考察腦內(nèi)MI對局部ATP刺激之后的反應,以及應用縫隙連接蛋白抑制劑Carbcnoxalone(CBX)對這一過程的影響來探討星形膠質(zhì)細胞是否參與ATP的釋放。
　　 利用經(jīng)典的致炎因子脂多糖(Lipopolysacchiride,LPS)作為MI的外周免疫激活劑,

2、考察LPS腹腔注射24小時后,MI的活化和Cx43的表達變化,同時觀察可能與MI急性期活化密切相關的P2Y12受體在腹腔注射LPS后的表達變化。
　　 方法：
　　 1、轉(zhuǎn)基因小鼠在體模型建立:選用6-8w的成年CX3CR1/GFP雜合小鼠作為實驗動物,于雙光子顯微鏡下存圖。
　　 2、活腦組織切片制備:采用6-8w的成年CX3CR1/GFP雜合小鼠作為實驗動物,在ACSF的冰水混合物中快速斷頭,迅速完整取出大腦

3、組織,于振蕩切片機切400um切片后分別置于ACSF或含刺激物的孵育系統(tǒng)中。切片在雙光子顯微鏡下存圖或孵育90分鐘后多聚甲醛固定備用。
　　 3、在體觀察MI突起活動:選用910nm波長,強度在30-40mw之間的激光作為MI存圖默認參數(shù),在距離腦表面150um以下的視野作為存圖區(qū),在Fluoview300軟件系統(tǒng)中存XYT模式動態(tài)圖像。
　　 4、離體切片共聚焦顯微鏡存圖:選用Cy2激光,在固定激光強度下和固定的FLu

4、oview300軟件參數(shù)情況下存取XYZ模式圖像。
　　 5、Cx43KO小鼠及野生小鼠LPS腹腔注射模型的建立:選用6-8w的KO和WT小鼠,LPS或生理鹽水腹腔注射,于24小時后,或4％多聚甲醛灌流固定后取出腦組織,或直接快速取腦冷凍后用于WesternBlot分析。
　　 6、Cx43、GFAP、Ibal免疫熒光染色7、Cx43、IL-1β、P2Y12受體Western blot8、各組間差異的比較應用配對t檢驗。

5、
　　 結果：
　　 1、顱腦開窗在體觀察MI活動:MI的突起時刻向各個方向運動；當局部發(fā)生激光損傷時,鄰近MI突起的運動方向一致伸向損傷區(qū)；局部給予ATP刺激能夠模擬激光損傷對MI突起的趨向性；激光損傷對MI突起的趨化作用可以被預先給予的250uMCBX所拮抗;激光損傷前預先給予經(jīng)典的P2X7受體拮抗劑BBG,不能抑制激光損傷后MI突起的運動。
　　 2、離體活組織切片不同組孵育結果:切片所造成的損傷能夠使MI

6、突起向損傷區(qū)伸展,CBX能夠抑制這種損傷所造成的趨向性,而ATP能夠加強這種趨化作用。
　　 3、Cx43在不同組別之間免疫染色和Westernblot分析結果:Cx43在KO-NS組和KO-LPS組均無表達,在WT-NS組有微弱表達,與GFAP共染后可見Cx43與GFAP有部分重疊。在WT-LPS組Cx43表達明顯增強。
　　 4、Ibal和GFAP免疫熒光在各組之間比較:在WT-LPS組和KO-LPS組,Ibal和G

7、FAP的表達均較NS兩組增強,MI和星形膠質(zhì)細胞形態(tài)活化。
　　 5、P2Y12受體和IL-1β的WesternBlot分析:LPS腹腔注射后腦內(nèi)P2Y12受體表達增強,WT-LPS組較KO-LPS組表達更強；LPS腹腔注射后腦內(nèi)IL-1β表達增強,WT-LPS組較KO-LPS組表達更強。
　　 結論：
　　 1、局部ATP刺激能夠活化MI。
　　 2、CBX能夠抑制激光損傷和ATP刺激對MI的活化。