Metformin通過選擇性活化小膠質(zhì)-巨噬細(xì)胞促進(jìn)腦缺血修復(fù).pdf

1、目的：在小鼠局灶性腦缺血再灌注模型中，研究經(jīng)典的 AMPK激動劑metformin延遲給藥能否通過活化AMPK，從而將缺血部位的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞從經(jīng)典的、促炎癥的M1極化狀態(tài)誘導(dǎo)為另類M2極化狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)缺血后腦損傷修復(fù)及神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　方法：采用線栓法建立小鼠局灶性腦缺血模型。小鼠缺血1h、再灌24h后每天腹腔注射metformin（50 mg/kg），對照組給以相同劑量的生理鹽水。缺血再灌3天、7天、14天、30天后

2、，以mNSS評分、Corner test、Rota-rod test三個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評價(jià)給藥后神經(jīng)功能恢復(fù)情況；收取腦組織，以Western Blot檢測AMPK磷酸化水平；收取腦組織，以Real-time PCR和免疫組織化學(xué)檢測缺血后紋狀體半暗帶區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞M1 maker（CD32和IL-1β）以及M2 maker（CD206和Arginase1） mRNA和蛋白表達(dá)水平；以ELISA法檢測缺血腦內(nèi) M2

3、 maker(IL-4和 IL-10)的水平。以 BrdU和新生神經(jīng)元標(biāo)志 Doublecortin（DCX）熒光雙標(biāo)新生神經(jīng)元，以免疫組化檢測缺血14天后腦內(nèi) SVZ區(qū)新生神經(jīng)元；以血管生成因子 CD31為標(biāo)記免疫組化法檢測缺血后腦內(nèi)血管新生。采用LPS誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的M1極化，研究metformin是否通過BV-2細(xì)胞的M2極化促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外血管新生。
　　結(jié)果：在小鼠局灶性腦缺血體內(nèi)模型中，metformi

4、n(50 mg/kg)顯著性改善缺血后腦損傷的神經(jīng)行為功能恢復(fù)。Western Blot結(jié)果顯示，給藥3天、14天后，腦組織AMPK的磷酸化水平顯著高于對照組（P<0.05）。Real-time PCR結(jié)果顯示：腦缺血后3、7、14、30天后，與對照組相比，metformim顯著降低缺血導(dǎo)致的 M1的marker(CD32、IL-1β)的誘導(dǎo)表達(dá)（P<0.05）；另一方面，與對照組相比，metformim顯著上調(diào)了缺血后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)M2的

5、marker(CD206、Arginase1)的表達(dá)（P<0.05）。免疫組化結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果一致，與對照組相比，metformim給藥組小鼠紋狀體缺血半暗帶區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞 M1的 maker（CD16/32）的表達(dá)下降（P<0.05），M2的maker（CD206）的表達(dá)增加（P<0.05）。ELISA結(jié)果顯示metformin也顯著提高缺血腦內(nèi)IL-4和IL-10的水平（P<0.05）。這些結(jié)果提示met

6、formin延遲給藥選擇性地將缺血部位的小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為另類 M2活化狀態(tài)。免疫熒光組化結(jié)果顯示，缺血再灌兩周后，metformin顯著增加腦室下區(qū)新生神經(jīng)元（BrdU/DCX雙陽性細(xì)胞）的數(shù)目（P<0.05）以及缺血側(cè)紋狀體新生血管蛋白標(biāo)記CD31的表達(dá)（P<0.05）。在LPS刺激BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥模型中，metformin(1 mM)降低了炎癥因子NO的釋放，同時(shí)顯著的增加了BV-2細(xì)胞IL-10的釋放，加入AMPK的

7、抑制劑Compound C（C-C）后IL-10的釋放顯著降低（P<0.05）。在體外血管新生實(shí)驗(yàn)中，metformin本身不能促進(jìn)bEnd3形成血管樣結(jié)構(gòu)，而metformin與 LPS共刺激誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞M2極化后的細(xì)胞上清顯著促進(jìn)bEnd3形成血管樣結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果提供證據(jù)表明metformin通過小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化促進(jìn)血管新生。
　　結(jié)論：在小鼠局灶性腦缺血再灌注模型中，metformin延遲給藥能夠促進(jìn)缺血后腦損傷修復(fù)以