銀杏內(nèi)酯B促進(jìn)缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞-巨噬細(xì)胞向M2亞型極化及其機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是目前人類健康的第二大殺手，嚴(yán)重威脅了人類健康。在腦卒中中，缺血性腦卒中約占85％，在我國(guó)已成為第一致死性疾病。目前的研究表明腦卒中的病理機(jī)制主要有:氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙、興奮性毒性以及神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些病理變化共同導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞的死亡，造成了嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。雖然對(duì)于缺血性腦卒中的病理機(jī)制目前已經(jīng)有了一定程度的認(rèn)識(shí)，然而針對(duì)腦卒中的治療藥物依然局限于重組組織纖維溶酶原激活劑(Recombinant tissueplasmi

2、nogen activator，r-tPA)。由于r-tPA的治療時(shí)間窗窄，不良反應(yīng)嚴(yán)重，因此尋找其他腦卒中治療藥物并研究其作用機(jī)制對(duì)于腦卒中的治療與保護(hù)是研究者亟待解決的重點(diǎn)課題。
　　在腦卒中發(fā)生后，“瀑布樣”的神經(jīng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)于神經(jīng)元的存亡起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)的主要是腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞和因血-腦屏障(BBB)破壞而浸潤(rùn)到中樞的外周巨噬細(xì)胞。這些小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞將通過(guò)參與和調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥從而影響腦卒中后神經(jīng)

3、元的命運(yùn)和腦組織的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。例如:通過(guò)經(jīng)典激活途徑極化成M1亞型的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞具有促炎作用，加重中樞炎癥反應(yīng);通過(guò)選擇性激活途徑極化成M2亞型的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞能發(fā)揮抗炎及保護(hù)作用，對(duì)抗中樞炎癥并參與組織修復(fù)。由此可見(jiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的極性對(duì)腦卒中的病理進(jìn)程起到了重要的調(diào)節(jié)作用，尤其在腦卒中的恢復(fù)期，炎性的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞將在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，不利于卒中后的損傷修復(fù)。因此，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的極性，作為一

4、個(gè)全新的治療策略，在近年越來(lái)越受到腦卒中研究者的關(guān)注。
　　銀杏內(nèi)酯B是銀杏葉提取物的重要活性成分，并因其為天然最強(qiáng)的血小板激活因子受體(Platelet Activator Factor Receptor，PAF receptor)的拮抗劑而受到廣泛地關(guān)注。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但作用機(jī)制目前尚不明確。因此，進(jìn)一步挖掘銀杏內(nèi)酯B的藥理作用與機(jī)制，將有利于加深我們對(duì)銀杏內(nèi)酯B—這一重要

5、神經(jīng)保護(hù)劑的認(rèn)識(shí)。
　　本文首先建立小鼠tMCAO模型研究銀杏內(nèi)酯B對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，確證了銀杏內(nèi)酯B對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用。之后，通過(guò)在體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞株極化成不同極性，探究銀杏內(nèi)酯B調(diào)節(jié)極化的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其與抑制血小板激活因子受體有關(guān)。本研究驗(yàn)證了銀杏內(nèi)酯B對(duì)腦卒中tMCAO模型的神經(jīng)保護(hù)作用，闡明了其通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而且探究了其

6、機(jī)制與可能拮抗PAF受體有關(guān)，揭示了銀杏內(nèi)酯B新的藥理作用，提示銀杏內(nèi)酯B可以用于治療其他小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化相關(guān)疾病。
　　目的:
　　研究銀杏內(nèi)酯B對(duì)小鼠缺血性腦卒中后的神經(jīng)保護(hù)作用以及對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用與機(jī)制。
　　方法:
　　1)選用月齡2～3個(gè)月的C57BL/6J小鼠，使用線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞（transient Middle Cerebral Artery Occlusion

7、，tMCAO）模型，缺血1h后再灌，于再灌后1h給與不同劑量的銀杏內(nèi)酯B注射液（1.75 mg/kg，3.5 mg/kg，7.0mg/kg)，腹腔注射給藥，一天兩次，持續(xù)3天。3天后，對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，并處死取腦。測(cè)定腦梗死體積及腦組織含水量，從而研究銀杏內(nèi)酯B治療缺血性腦卒中的有效劑量。
　　2)選擇銀杏內(nèi)酯B(3.5 mg/kg，ip，bid，3d&7d)于腦缺血1h再灌給藥，應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察銀杏內(nèi)酯B對(duì)缺血性腦卒

8、中后缺血半影區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的極化是否有調(diào)節(jié)作用;同時(shí)取治療3天及7天的腦組織，進(jìn)行勻漿處理，利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒對(duì)極化相關(guān)因子:M1相關(guān)細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)及M2相關(guān)細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10)進(jìn)行檢測(cè)。此外，采用Real-time PCR研究銀杏內(nèi)酯B對(duì)tMCAO造模后腦組織中極化相關(guān)因子（iNOS、CCL2、TNF-α、C

9、D206、Ym1和Arg1）mRNA水平的調(diào)節(jié)作用。利用以上三種實(shí)驗(yàn)手段研究銀杏內(nèi)酯B對(duì)tMCAO腦缺血模型后小鼠大腦半影區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用。
　　3)培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞和小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞，在離體上通過(guò)給予LPS+IFN-γ或IL-4極化誘導(dǎo)物及銀杏內(nèi)酯B(1μM)，在體外驗(yàn)證GB對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用。利用ELISA和Real-time PCR檢測(cè)GB對(duì)釋放的細(xì)胞因子蛋白和mRNA水平

10、的調(diào)節(jié)作用。
　　4)另外，在小膠質(zhì)細(xì)胞上，利用流式細(xì)胞術(shù)(Flow-cytometry，F(xiàn)C)檢測(cè)不同亞型標(biāo)志性的趨化因子蛋白的表達(dá)，從而鑒定銀杏內(nèi)酯B對(duì)極化的調(diào)節(jié)作
　　5)培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞，在離體上通過(guò)給予LPS+IFN-γ先將BV2細(xì)胞誘導(dǎo)成M1型再給與M2型誘導(dǎo)物IL-4，觀察銀杏內(nèi)酯B（1μM）對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用;再給與PAF受體拮抗劑CV3988（10μM），對(duì)比GB對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨

11、噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用的改變。
　　6)利用靶向于PAF受體的siRNA干擾PAF受體的表達(dá)，利用WesternBlotting法檢測(cè)干擾效率。
　　7)利用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、Real-time-PCR檢測(cè)BV2細(xì)胞極性的變化，探究拮抗PAF受體是否為GB調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化作用的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1)使用銀杏內(nèi)酯B(3.5 mg/kg，7.0 mg/kg)對(duì)tMCAO缺血三天小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。GB可

12、顯著減少tMCAO引起的小鼠的腦梗死體積，緩解腦水腫程度，并改善神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分。其中3.5 mg/kg是最小有效劑量，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用3.5 mg/kg進(jìn)行給藥。
　　2)tMCAO術(shù)后3天及7天，銀杏內(nèi)酯B均可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向M2型極化。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GB可促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面趨化因子CD206的表達(dá)并減少M(fèi)1型趨化因子CD16/32的表達(dá);同時(shí)利用ELISA和real-timePCR檢測(cè)腦組

13、織中M1/2亞型相關(guān)炎癥因子，發(fā)現(xiàn)GB可以增加M2相關(guān)因子的表達(dá)和釋放并抑制M1亞型相關(guān)因子的產(chǎn)生和釋放。
　　3)先將小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2和骨髓源性巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成M1亞型，再給予GB和M2亞型的誘導(dǎo)物，GB能夠顯著促進(jìn)以上兩種細(xì)胞向M2型極化。
　　4)使用CV3988（10μM），得到和GB相似的極化調(diào)節(jié)作用，提示GB對(duì)極化的調(diào)節(jié)作用可能涉及對(duì)PAF受體的拮抗作用。
　　5)通過(guò)使用siRNA干擾PAF受體的表達(dá)，驗(yàn)

14、證拮抗PAF受體為GB調(diào)節(jié)極化的機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　1)GB能夠促進(jìn)小鼠缺血性腦卒中后的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向M2型極化并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2)拮抗PAF受體為GB調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的可能機(jī)制。
　　綜上所述，本文的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于:
　　1)GB通過(guò)調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用
　　GB能夠顯著減輕小鼠腦缺血再灌注所致的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、腦水腫程度以及減少腦組織梗

15、死體積。并促進(jìn)缺血性腦卒中后的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2)GB通過(guò)拮抗PAF受體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化
　　GB是自然界最強(qiáng)的PAF受體拮抗劑，通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)和siRNA干擾技術(shù)，闡明了拮抗PAF受體為GB調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的可能機(jī)制，揭示了PAF受體在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性中的重要作用。
　　本研究闡明了GB的新的藥理機(jī)制，揭示了其發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用的可能機(jī)制，提示了GB用于治療其