M2型巨噬細胞對急性肺損傷小鼠的保護作用及其機制研究.pdf

1、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)，是重癥監(jiān)護病房(ICU)多器官功能障礙綜合征(MODS)中肺部的首要表現(xiàn)，常由創(chuàng)傷、燒傷、感染、休克等多種因素所誘發(fā)，病情嚴重且進展迅速。近年來，眾多學者圍繞ALI/ARDS的發(fā)病機制和防治策略進行了廣泛的研究，但仍缺乏快速高效的治療方案，發(fā)病率和死亡率仍居高不下。巨噬細胞是機體免疫防御系統(tǒng)中最重要的細胞之一，其在機體的免疫監(jiān)視、免疫引發(fā)和病原清除中均擔任重要角色，可以識別侵入機體的致

2、病原，并誘發(fā)免疫反應以達到清除致病原的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展的過程中，巨噬細胞的大量激活和后期凋亡均與其病理改變有著密切聯(lián)系。早期在體內(nèi)外各類病原刺激物的作用下，M1型巨噬細胞大量激活，分泌各類促炎性細胞因子和其他炎癥介質，使中性粒細胞大量活化并遷移至炎癥部位，促進肺部炎癥爆發(fā)且導致肺部組織損傷，肺血管通透性增加，產(chǎn)生肺水腫。在肺損傷的晚期，巨噬細胞更多地呈現(xiàn)為M2型，功能主要在于抑制炎癥反應，吞噬中性粒細胞，分泌抗炎性

3、細胞因子和介質，促進膠原合成和傷口修復等。但若前述過度激活的炎癥反應發(fā)生失控，巨噬細胞在促炎和抑炎的過程中功能失衡。吞噬了中性粒細胞的巨噬細胞功能下降，并可發(fā)生凋亡或細胞焦亡等形式的程序性死亡，使巨噬細胞數(shù)量減少，機體的抗炎功能進一步降低，肺部炎癥和組織損傷進一步加重。因此，明確巨噬細胞在急性肺損傷中發(fā)生發(fā)展中的作用特點和機制，對于探索肺損傷的治療方案有著重要的啟示和作用。
　　在本課題中，首先利用C57BL/6小鼠，培養(yǎng)并獲取骨

4、髓源性M2型巨噬細胞，隨后進行小鼠體內(nèi)的干預治療，觀察外源性的M2型巨噬細胞補充對肺損傷小鼠肺部炎癥因子、細胞浸潤、蛋白滲出、水腫和肺組織病理損傷的影響和規(guī)律。最后，根據(jù)變化特點，通過體外培養(yǎng)和抗體阻斷相結合等方法，進一步探索其所引起變化的可能和潛在機制。
　　第一部分:骨髓源性M2型巨噬細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　用骨髓細胞分化的方法培養(yǎng)出符合實驗要求的骨髓源性M2型巨噬細胞。
　　方法:
　　1.

5、選取4-5 w的健康雄性野生型C57BL/6小鼠，處死后收集下肢股骨和近端脛骨骨髓腔內(nèi)的原始骨髓細胞，給予巨噬細胞集落刺激因子M-CSF誘導分化7天后，更換為細胞因子IL-4分化1天，獲得骨髓源性M2型巨噬細胞。
　　2.收集培養(yǎng)獲得的M2型巨噬細胞，以F4/80抗體和CD206抗體作為標記，經(jīng)流式細胞術檢測培養(yǎng)所得的M2型巨噬細胞的純度。
　　結果:
　　給予M-CSF、IL-4誘導分化原始骨髓細胞，得到M2型巨噬細

6、胞。該細胞生長狀態(tài)良好，鏡下形態(tài)滿意。經(jīng)流式檢測后M2型巨噬細胞純度理想，可到90％以上，滿足實驗要求。
　　結論:
　　骨髓源性M2型巨噬細胞培養(yǎng)成功，后續(xù)試驗可順利進行。
　　第二部分:M2型巨噬細胞對急性肺損傷小鼠肺部的保護作用
　　目的:
　　探索M2型巨噬細胞對LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺部炎癥反應和病理損傷的影響。
　　方法:
　　取6-8w的C57BL/6小鼠按每組6只的方式隨機分

7、為3組:假手術(Sham)組，模型(LPS)組和細胞治療(M2)組。經(jīng)脂多糖(LPS)誘導ALI模型后3h，M2組小鼠經(jīng)肺內(nèi)給予無菌M2型巨噬細胞懸液輸注。分別在肺損傷造模后6h、24h處死小鼠，獲得肺損傷小鼠的肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)待后續(xù)檢測。
　　1.流式細胞術進行BALF中性粒細胞和T細胞計數(shù)。
　　2.BCA法檢測BALF中蛋白濃度。
　　3.ELISA法檢測BALF中細胞因子TNF-α，IL-6

8、，IL-1β，IL-10的分泌。
　　4.對小鼠肺組織進行干濕比稱重計算。
　　5.將小鼠肺組織做石蠟切片進行HE染色，然后行病理學評分。
　　結果:
　　1.在術后6h和24h，M2組小鼠BALF中中性粒細胞較LPS組明顯減少;在術后24h，M2組小鼠BALF中T細胞較LPS組增加(P＜0.05)。
　　2.在肺損傷后6h和24h，M2組小鼠BALF中蛋白濃度較LPS組明顯降低(P＜0.05)。
　

9、　3.在6h和24h，M2組較之LPS組，BALF中促炎性細胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β水平均有明顯降低，而抑炎性細胞因子IL-10分泌增加(P＜0.05)。
　　4.在肺損傷后6h，M2組與LPS組干濕比未無差異;但在術后24h，M2組小鼠肺組織干濕比較LPS組明顯降低，證明肺水腫得到緩解(P＜0.05)。
　　5.在肺損傷后6h和24h，M2組小鼠肺部的病理損傷均較LPS組均有明顯減輕，病理評分顯著降低(P＜0

10、.05)。
　　結論:
　　骨髓源性M2型巨噬細胞對急性肺損傷小鼠的肺部具有保護作用。M2型巨噬細胞可以緩解小鼠肺部病理損傷，降低富蛋白液的滲出，減少中性粒細胞浸潤，調(diào)節(jié)炎性細胞因子的分泌。
　　第三部分:M2型巨噬細胞對小鼠肺部保護作用的機制研究
　　目的:
　　探討骨髓源性M2型巨噬細胞對小鼠急性肺損傷保護作用的可能機制。
　　方法:
　　1.將培養(yǎng)所得的M0和M2型巨噬細胞進行消化計數(shù)后，

11、按照[M0/M2]細胞數(shù)[1∶10]、[1∶1]、[10∶1]的不同比例進行混合共培養(yǎng)，給予LPS刺激24h后，收集上清，ELISA檢測細胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β和IL-10的表達水平。
　　2.流式細胞術檢測M2型巨噬細胞表面PD-L1分子的表達。
　　3.流式細胞術檢測M2型巨噬細胞治療后BALF中T細胞表面PD-1的表達。
　　4.將小鼠隨機分為4組:假手術(Sham)組，模型(LPS)組，Isot

12、ype抗體(Isotype)組和Anti-PD-L1抗體(Anti-PD-L1)組。經(jīng)LPS造模后3h，Anti-PD-L1組予Anti-PD-L1抗體肺內(nèi)滴注后，同時予以M2型巨噬細胞輸注。在肺損傷24h處死小鼠收取BALF，檢測細胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β和IL-10的濃度。
　　結果:
　　1.M0/M2共培養(yǎng)結果顯示:伴隨著M2型巨噬細胞比例的增加，促炎性細胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β的分泌逐漸

13、降低;同時，M2型巨噬細胞數(shù)量的增加同時，抑炎性細胞因子IL-10的分泌也呈現(xiàn)出降低趨勢(P＜0.05)。
　　2.M2型巨噬細胞表面高表達PD-L1分子，其陽性率達99％±1.8％以上。
　　3.M2型巨噬細胞治療后BALF中T細胞表面高表達PD-1分子，陽性率達95％±4.1％以上。
　　4.在阻斷PD-L1信號再輸注M2型巨噬細胞，小鼠肺部炎癥因子并未得到降低，反而有升高趨勢。阻斷PD-L1分子小鼠肺部細胞因子T