老年大鼠急性肺損傷時(shí)肺泡巨噬細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、背景：老年多器官功能衰竭(MOFE)常常由肺功能不全引發(fā)，MOFE的發(fā)病誘因中，肺部感染占82.8％。隨著“肺啟動(dòng)”假說的提出，這一臨床現(xiàn)象得到了很好的解釋。因此明確MOFE肺啟動(dòng)的機(jī)理，并針對(duì)性的預(yù)防和治療，是降低MOFE發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。我們先前的研究證明：老年大鼠與青年大鼠相比，在用酵母多糖刺激后所致的多臟器衰竭模型中，AM的凋亡率明顯增加。老年AM的凋亡增加一方面造成感染的失控，另一方面造成炎癥失控。因此認(rèn)為，這很可能是老年

2、肺部感染后炎癥不易控制以及肺部感染或肺損傷后容易引起MOFE的重要原因，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。本研究主要探討線粒體介導(dǎo)的凋亡通路及其相關(guān)因素在老齡大鼠急性肺損傷中的作用，其中重點(diǎn)探索線粒體介導(dǎo)的caspase蛋白酶相關(guān)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)老齡大鼠急性肺損傷肺泡巨噬細(xì)胞凋亡的作用。 目的：探討caspase-9及其相關(guān)基因在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的老年大鼠ALI時(shí)AM凋亡中的作用，為臨床預(yù)防及治療MOFE提供理論基礎(chǔ)。 方法：本實(shí)

3、驗(yàn)第一部分采用D-半乳糖對(duì)大鼠進(jìn)行催老，并提取AM。采用光鏡、電鏡比較老齡以及青年大鼠AM細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，并測定大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量改變。第二部分使用脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，在不同干預(yù)時(shí)間采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡百分率，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測caspase-9和Apaf-1mRNA的表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，應(yīng)用蛋白印記技術(shù)檢測caspase-9蛋白

4、的表達(dá)。 結(jié)果：D-半乳糖制備老齡大鼠模型，大鼠呈現(xiàn)出明顯的衰老體征，D-gal組大鼠6周后血清SOD活性明顯下降，血清MDA含量較實(shí)驗(yàn)前明顯升高(P＜0.01)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)老齡大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)顆粒增多。在使用LPS干預(yù)后不同時(shí)間，老齡大鼠巨噬細(xì)胞凋亡率在0.5小時(shí)內(nèi)即有明顯增加，隨著時(shí)間的延長凋亡率隨之增加，在2小時(shí)左右達(dá)到高峰，2小時(shí)后凋亡率慢慢降低。caspase-9mRNA的表達(dá)有所增強(qiáng)，干預(yù)后2h達(dá)到高峰。但Apaf-

5、1mRNA的表達(dá)維持正常水平，干預(yù)1h之內(nèi)與對(duì)照組比較無顯著性差異。LPS干預(yù)0.5h后Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)開始明顯上調(diào)，之后開始下降，但仍高于對(duì)照組(P＜0.05)。干預(yù)0.5h后Bax在AM中的表達(dá)開始增高，隨著干預(yù)時(shí)間的延長，其表達(dá)不斷增加，4h后達(dá)高峰。Bcl-2/Bax的比率在干預(yù)后0.5h時(shí)發(fā)現(xiàn)升高，1h后開始下降。 結(jié)論：(1)D-半乳糖致衰老模型是一種較為理想的老齡動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，D-半乳糖對(duì)機(jī)體的損傷作用與反應(yīng)

6、性氧族(ROS)相關(guān)。老齡大鼠AM形態(tài)學(xué)改變可能與其肺部感染或肺損傷后更易引起MOFE相關(guān)。(2)老齡大鼠AM在LPS干預(yù)后，細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)caspase-9表達(dá)增加，提示線粒體通路介導(dǎo)的凋亡途徑在老齡大鼠AM凋亡過程中起重要作用。(3)Bcl-2/Bax比率在LPS干預(yù)后一過性升高，提示LPS干預(yù)早期抗凋亡的保護(hù)因素占優(yōu)；隨著干預(yù)時(shí)間延長，Bcl-2/Bax比率下降，AM凋亡程度增加，提示Bcl-2/Bax比率改變與老齡大鼠肺泡巨