NEMO-結合肽對脂多糖誘導急性肺損傷小鼠的肺保護作用及機制探討.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩135頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、研究背景和目的:急性肺損傷(ALI)及其更嚴重階段急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床危重癥發(fā)生急性呼吸衰竭的主要原因,病死率高達50%。ALI/ARDS發(fā)病機制錯綜復雜,目前為止尚未完全闡明,各種以肺為靶目標的的傳染病、生物化學損傷、嚴重外傷與創(chuàng)傷后感染、休克、中毒均可成為ALI的主要發(fā)病因素,其病理基礎均表現(xiàn)為肺內失控的炎癥反應所致的肺毛細血管膜損傷,肺水腫及透明膜形成。
   雖然機械通氣和全身激素治療在一定程度上延緩了A

2、LI/ARDS的進展,但是目前臨床仍缺乏針對ALI/ARDS的有效免疫調控及肺保護手段。由于參與ALI炎癥反應及氧化應激損傷的介質眾多,且彼此相互聯(lián)系、互為因果,在治療過程中針對單一介質的單克隆抗體、拮抗劑、抑制劑等均未取得滿意的防治效果。此外,炎癥介質為機體所必需,過多或不足均會造成損害,而使用抑制劑等劑量與時機很難把握,常使此類研究陷入困境。
   核因子KappaB(NF-κB)信號通路是啟動炎癥反應的關鍵通路,在感染及創(chuàng)

3、傷等多種因素誘發(fā)的炎癥反應及氧化應激損傷中起重要作用。NF-κB是廣泛存在于細胞漿中的一種快反應轉錄因子,靜息狀態(tài)下,NF-κB與其抑制因子IκB結合以無活性的三聚體形式存在于細胞漿。當細胞受到細胞因子、促炎介質、病毒及細菌分解物等外界刺激后,NF-κB被激活并迅速從細胞漿轉位到細胞核,在胞核內與相應基因上的κB位點發(fā)生特異性結合,調控細胞因子、化學趨化因子、生長因子、粘附分子、誘生型一氧化氮合成酶和協(xié)同刺激分子等相關基因的表達,進而參

4、與機體炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等。抑制NF-κB活化不僅可以降低炎癥損傷,還可以同時減弱氧化應激,減少細胞組織的損傷。已有研究證明抑制NF-κB活化可以明顯地降低脂多糖(LPS)所致的感染性休克小鼠死亡率。本課題組前期研究與其他國外研究均顯示抑制NF-κB過度活化可減少TNF-α誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應、氧化應激損傷及凋亡。因此,我們推測,NF-κB是連接ALI炎癥反應與氧化應激的重要節(jié)點,對NF-κB的活性進行調控是同時下調AL

5、I炎癥反應與減輕氧化應激損傷的關鍵。
   通過抑制IκB激酶(IKK)活性進而下調NF-κB活化程度是當前研究ALI/ARDS干預策略的熱點。IKK對IκB的磷酸化是NF-κB活化的關鍵步驟,是NF-κB在炎癥反應過程中激活的經(jīng)典途徑。IKK由IKKα、IKKB和IKKγ三個亞單位組成,其中IKKγ又稱NEMO,是IKK的調節(jié)亞單位。研究證實IKK活化經(jīng)典的NF-κB信號通路依賴IKKγ的完整性。目前已經(jīng)有了針對IKK調節(jié)亞單

6、位NEMO的結合肽(NBD),NBD可與NEMO特異性結合從而阻斷IKK復合物的組裝并下調IKK活性,進而抑制NF-κB活化。但是如何把穩(wěn)定的具有生物學活性的NBD靶向導入到肺臟以及如何把握NBD使用劑量與給藥時機,以便更好低改善ALI失控的炎癥反應和氧化損傷,目前未見相關研究。
   在藥劑學領域,使用藥物載體是改善藥效,提高藥物靶向性與減少藥物不良反應的一種措施。本研究擬利用外源性肺泡表面活性物質(PS)包封NBD,再經(jīng)氣管

7、內霧化的形式靶向肺部給藥,在提高藥物穩(wěn)定性的同時,能更大可能性地改善NBD對肺組織的親和力和促進NBD進入肺結構細胞以抑制NF-κB信號通路的活化,而外源性PS則可補充炎癥反應或氧化應激中損失的肺泡表面活性物質,以協(xié)同達到糾正ALI病理損傷、維持正常呼吸功能的目的。
   綜上所述,本課題的研究目的如下:
   1、采用氣管內霧化、氣管內滴入和腹腔注射LPS復制ALI小鼠模型,評估LPS經(jīng)不同給藥方式致小鼠肺組織病理損傷

8、及炎癥反應程度,選則手術創(chuàng)傷小、操作簡便且最接近ALI病理特點的小鼠模型。
   2、確定最佳造模方式之后,不同劑量的NBD經(jīng)氣管內霧化預處理0.5h,評價NBD預處理對ALI小鼠肺組織過度炎癥反應及氧化應激損傷的影響。
   3、選擇合適劑量的NBD充分溶解于外源性PS,探討NBD聯(lián)合PS預處理對ALI小鼠肺組織過度炎癥反應的影響及作用機制。
   方法:
   l、LPS經(jīng)不同給藥方式致ALI小鼠模型

9、的比較研究
   12周齡,SPF級雄性BLAB/c小鼠隨機分為正常對照組(NC group)、氣管內霧化組(ITA group)、氣管內滴入組(ITI group)和腹腔注射組(IPI group),每組21只。NC組小鼠腹腔注射0.1mL水合氯醛麻醉后氣管內霧化噴入100μL空氣;ITA組小鼠麻醉后氣管內霧化噴入LPS溶液100μL(1mg/mL);ITI組小鼠麻醉后氣管內滴入LPS溶液100μL(1 mg/mL); IPI

10、組小鼠腹腔注射LPS溶液100μL(1mg/mL)。ITA組和ITI組各取3只小鼠用伊文斯藍溶液取代LPS溶液以顯示氣管內霧化和滴入時藥物的肺內分布。LPS給藥2h后麻醉并剪斷腹主動脈放血處死全部小鼠,充分暴露胸腔,分別取肺組織行干濕重比、HE染色及病理評分;ELISA檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-1β濃度;Real-time RT-PCR檢測小鼠肺組織TNF-α和IL-1βmRNA轉錄水平;Western B

11、lot檢測小鼠肺組織IκB-α蛋白含量及IκB-α和NF-κBp65蛋白磷酸化水平。
   2 、NBD預處理對LPS誘導ALI小鼠過度炎癥反應及氧化應激的影響
   12周齡,SPF級雄性BLAB/c小鼠隨機分為對照組(control)、模型組(model)、NBD陰性對照組(N-NBD)、NBD低劑量組(S-NBD)、NBD中劑量組(M-NBD)和NBD高劑量組(L-NBD),每組18只。對照組小鼠腹腔注射0.1mL

12、水合氯醛麻醉后氣管內霧化噴入100μL空氣;模型組小鼠麻醉后氣管內霧化LPS溶液100μL(1mg/mL); NBD陰性對照組及NBD低中高劑量組小鼠麻醉后分別經(jīng)氣管內霧化噴入相應劑量的NBD陰性對照溶液及NBD溶液50μL,0.5h后再次經(jīng)氣管內霧化LPS溶液50μL(2mg/mL),LPS給藥2h后麻醉并剪斷腹主動脈放血處死全部小鼠。充分暴露胸腔取小鼠全肺組織行病理切片、HE染色及病理評分,ELISA檢測小鼠BALF中TNF-α和I

13、L-1β濃度;Real-time RT-PCR檢測肺組織TNF-α、IL-1β、NOX1、NOX2和NOX4 mRNA轉錄水平;Western Blot檢測肺組織IκB-α、NOX1、NOX2、NOX4蛋白含量及IκB-α、NF-κB p65蛋白磷酸化水平;比色法檢測肺組織超氧化物歧化酶活力(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)濃度。
   3、NBD聯(lián)合PS預處理對LPS誘導ALI小鼠過度炎癥反應及信號通路的

14、影響
   12周齡,SPF級雄性BLAB/c小鼠隨機平均分為對照組(control)、模型組(model)、PS組、PS+(N-NBD)組、PS+NBD組和NBD組,每組12只。對照組及模型組小鼠造模方法同第二章;PS和NBD組小鼠麻醉后氣管內霧化相應劑量的單藥PS和NBD50μL0.5h后,再次經(jīng)氣管內霧化LPS溶液50μL(2mg/mL);PS+(N-NBD)和PS+NBD組小鼠麻醉后經(jīng)氣管內霧化相應劑量的PS+(N-NB

15、D)和PS+NBD混合制劑50μL0.5h后,再次經(jīng)氣管內霧化LPS溶液50μL(2mg/mL)。LPS給藥2h后麻醉并剪斷腹主動脈放血處死全部小鼠,ELISA檢測小鼠BALE中TNF-α和IL-1β濃度,Real-time RT-PCR檢測肺組織TNF-α和IL-1β mRNA轉錄水平,Western Blot檢測肺組織IκB-α、NF-κB、P38MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達及磷酸化水平。
   4、統(tǒng)計學處理

16、r>   應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差((X)±s)表示。所有數(shù)據(jù)均進行方差齊性檢驗,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。方差齊時多重比較采用LSD檢驗法,方差不齊時多重比較采用Dunnett's T3檢驗法,顯著性水準α取0.05,雙側。
   結果:
   1、LPS經(jīng)不同給藥方式致ALI小鼠模型的比較研究
   1.1氣管內霧化伊文斯藍溶液的小鼠肺組

17、織藍染區(qū)域較分散,呈點狀或斑片狀分布于各肺葉。氣管內滴入伊文斯藍溶液的小鼠肺組織藍染區(qū)域分布較集中,主要集中在主氣管兩側,呈塊狀分布,部分標本的伊文斯藍溶液僅分布于個別肺葉,其余肺葉則未見藍染。
   1.2各組小鼠肺組織濕/干重比例差異有統(tǒng)計學意義。ITA組、ITI組和IPI組肺濕/干重比例均顯著高于NC組,而ITA組、ITI組和IPI組之間差異無統(tǒng)計學意義。
   1.3各組小鼠肺組織病理評分差異有統(tǒng)計學意義。ITA

18、組、ITI組和IPI組病理評分均顯著高于對照組,其中ITA組和ITI組均顯著高于IPI組,而ITA組和ITI組之間差異無統(tǒng)計學意義。NC組小鼠肺泡結構清晰,肺泡壁薄,肺間質無炎癥細胞浸潤。ITA組小鼠各肺葉均存在彌漫性的肺泡間隔增厚與肺泡壁破壞,肺間質炎癥細胞浸潤與出血,血管床不同程度破壞。ITI組小鼠部分肺葉結構破壞嚴重,部分肺葉結構相對完整,肺葉之間病灶不均勻。IPI組小鼠在肺泡結構、血管床破壞程度和炎癥細胞浸潤方面均較輕,1.4各

19、組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β濃度差異有統(tǒng)計學意義。ITA組、ITI組和IPI組TNF-α和IL-1β濃度均較NC組增高,差異有統(tǒng)計學意義。ITA組和ITI組TNF-α濃度均顯著高于IPI組,而ITA組和ITI組比較差異無統(tǒng)計學意義。ITA組IL-1β濃度顯著高于ITI組和IPI組,ITI組又顯著高于IPI組。
   1.5各組小鼠肺組織TNF-α和IL-1β mRNA轉錄水平差異有統(tǒng)計學意義。ITA組、ITI組和IPI

20、組TNF-α和IL-1βmRNA轉錄水平均較NC組增高,差異有統(tǒng)計學意義。ITA組TNF-αmRNA轉錄水平顯著高于ITI組和IPI組,而ITI組又顯著高于IPI組。ITA組IL-1β mRNA轉錄水平顯著高于ITI組和IPI組,ITI組又顯著高于IPI組。
   1.6各組小鼠肺組織IκB-α蛋白含量及IκB-α、NF-κB p65磷酸化水平差異有統(tǒng)計學意義。ITA組、ITI組和IPI組IκB-α蛋白含量均較NC組減少,差異有

21、統(tǒng)計學意義。ITA組和ITI組IκB-α磷酸化水平均較NC組顯著增加,而IPI組和NC組間差異無統(tǒng)計學意義。ITA組和ITI組NF-κBp65磷酸化水平均較NC組顯著增加,而IPI組和NC組間差異無統(tǒng)計學意義。ITA組IκB-α蛋白含量均顯著低于ITI組和IPI組,而ITI組又顯著低于IPI組。ITA組IκB-α磷酸化水平顯著高于ITI組和IPI組,ITI組又顯著高于IPI組。ITA組和ITI組肺組織NF-κ Bp65磷酸化水平均顯著高

22、于IPI組,而ITA和ITI組比較差異無統(tǒng)計學意義。
   2 NBD預處理對LPS誘導ALI小鼠過度炎癥反應及氧化應激失衡的影響
   2.1各組小鼠肺組織病理評分差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組病理評分顯著高于對照組。給予NBD預處理0.5h,NBD低中高劑量組病理評分均較模型組降低,差異有統(tǒng)計學意義。NBD中劑量組和高劑量組病理評分均顯著低于NBD低劑量組(P=0.038和P=0.004),而NBD高劑量

23、組與中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義。對照組小鼠肺泡結構清晰,肺泡壁薄,肺間質無炎癥細胞浸潤。模型組和NBD陰性對照組小鼠各肺葉均存在彌漫性的肺泡間隔增厚、肺泡壁破壞以及肺泡塌陷,肺間質炎癥細胞浸潤與出血,血管床不同程度破壞。給予低中高劑量NBD預處理0.5h,可以顯著減輕LPS誘導的肺組織病理損傷,并且NBD的肺組織保護作用呈現(xiàn)濃度依賴性增強。
   2.2各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β濃度差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2

24、h后,模型組TNF-α和IL-1β濃度均較對照組升高,差異有統(tǒng)計學意義。給予NBD預處理0.5h,NBD低中高劑量組TNF-α和IL-1β濃度均較模型組降低,差異有統(tǒng)計學意義。NBD低中高劑量組間TNF-α濃度呈濃度依賴性降低,差異有統(tǒng)計學意義。NBD中劑量組和高劑量組IL-1β濃度均低于NBD低劑量組,差異有統(tǒng)計學意義,而NBD高劑量組與中劑量組相比無統(tǒng)計學差異。
   2.3各組小鼠肺組織TNF-α和IL-1β mRNA轉錄

25、水平差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組TNF-α和IL-1βmRNA轉錄水平均較對照組升高,差異有統(tǒng)計學意義。給予NBD預處理0.5h,NBD中劑量和高劑量組TNF-α和IL-1β mRNA轉錄水平均較模型組顯著降低。NBD低中高劑量組間TNF-α和IL-1β mRNA轉錄水平呈濃度依賴性降低,差異有統(tǒng)計學意義。
   2.4各組小鼠肺組織IκB-α蛋白含量及IκB-α、NF-κB p65蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計學意義。

26、LPS給藥2h后,模型組IκB-α蛋白含量較對照組顯著減少,而IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平均較對照組顯著增加。給予NBD預處理0.5h,NBD低中高劑量組IκB-α蛋白含量均較模型組增加,差異有統(tǒng)計學意義,而IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平均較模型組減少,差異有統(tǒng)計學意義。NBD中劑量組IκB-α蛋白含量較NBD低劑量組顯著增高,而NBD高劑量組與低中劑量組比較差異均無統(tǒng)計學意義。NBD低中高劑量組間肺組織IκB-α

27、和NF-κ Bp65蛋白磷酸化水平呈濃度依賴性降低,差異有統(tǒng)計學意義。
   2.5各組小鼠肺組織SOD、T-AOC和MDA濃度差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組SOD和T-AOC濃度均較對照組顯著降低,而MDA濃度較對照組顯著增高。給予NBD預處理0.5h,NBD中劑量組和高劑量組SOD和T-AOC濃度均較模型組顯著增高,而NBD低劑量組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義。NBD低中高劑量組MDA濃度均較模型組降低,差異有

28、統(tǒng)計學意義。NBD中劑量組和高劑量組MDA濃度均較NBD低劑量組降低,差異有統(tǒng)計學意義,而NBD中劑量和高劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。
   2.6各組小鼠肺組織NOX1、NOX2和NOX4 mRNA轉錄水平差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組NOX1、NOX2和NOX4 mRNA轉錄水平均較對照組顯著升高。給予NBD預處理0.5h,NBD低中高劑量組NOX1、NOX2和NOX4 mRNA轉錄水平均較模型組降低,差異有

29、統(tǒng)計學意義。NBD中劑量組和高劑量組NOX1、NOX2和NOX4mRNA轉錄水平均顯著低于NBD低劑量組,而NBD高劑量組與中劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義。
   2.7各組小鼠肺組織NOX1、NOX2和NOX4蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組NOX1、NOX2和NOX4蛋白表達水平均較對照組增加,差異有統(tǒng)計學意義。給予NBD預處理0.5h,NBD中劑量組和高劑量組肺組織NOX1和NOX2蛋白表達水平均較模型

30、組顯著減少,而NBD低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義,NBD低中高劑量組NOX4蛋白表達水平均較模型組顯著減少。NBD低中高劑量組間NOX1蛋白表達水平呈濃度依賴性降低,差異有統(tǒng)計學意義。NBD高劑量組NOX2蛋白表達水平較NBD低劑量組顯著降低,而NBD中劑量與與低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義。NBD中劑量組和高劑量組NOX4蛋白表達水平均較NBD低劑量組顯著降低,而NBD中劑量和高劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。
   3

31、、PS聯(lián)合NBD預處理對LPS誘導ALI小鼠過度炎癥反應的影響及機制研究
   3.1各組小鼠BALF中TNF-α和IL-1β濃度差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組TNF-α和IL-1β濃度均較對照組顯升高,差異有統(tǒng)計學意義。PS組、NBD組和PS+NBD組TNF-α和IL-1β濃度均較模型組降低,差異有統(tǒng)計學意義。PS+NBD組TNF-α和IL-1β濃度均較PS組顯著降低,而PS+NBD組與NBD組之間無統(tǒng)計學意義差異

32、。
   3.2各組小鼠肺組織TNF-α和IL-1β mRNA轉錄水平差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組TNF-α和IL-1βmRNA轉錄水平較均較對照組顯著升高。PS組、NBD組和PS+NBD組TNF-α和IL-1β mRNA轉錄水平均顯著低于模型組。PS+NBD組TNF-α mRNA轉錄水平均較PS和NBD單藥組顯著降低,而IL-1β mRNA轉錄水平僅較PS組顯著降低,與NBD組相比差異無統(tǒng)計學意義。
  

33、 3.3各組小鼠肺組織IκB-α蛋白含量及IκB-α、NF-κ Bp65蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組IκκB-α含量較對照組顯著減少,而IκB-α和NF-κ Bp65磷酸化水平均較對照組顯著增加。PS組、NBD組和PS+NBD組IκB-α含量均較模型組顯著增加,而IκB-α和NF-κBp65磷酸化水平均較模型組顯著降低。PS+NBD組IκB-α含量較PS組顯著增加,而與NBD組相比差異無統(tǒng)計學意義。PS+NB

34、D組IκB-α和NF-κ Bp65磷酸化水平均較PS和NBD組顯著降低,而PS組和NBD組之間差異無統(tǒng)計學意義。
   3.4各組小鼠肺組織P38MAPK、ERK1/2和.JNK蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計學意義。LPS給藥2h后,模型組P38MAPK、ErK1/2和JNK磷酸化水平均較對照組顯著增加。PS組肺組織P38MAPK磷酸化水平較模型組顯著減少,而PS+NBD組和NBD組與模型組相比,差異均無統(tǒng)計學意義。PS組ERK1/2

35、磷酸化水平與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義,而PS+NBD組和NBD組均較模型組顯著降低。PS組、NBD組和PS+NBD組JNK磷酸化水平均較模型組顯著降低,而PS組、NBD組和PS+NBD組之間差異無統(tǒng)計學意義。
   結論:
   1.與氣管內滴入和腹腔注射相比,氣管內霧化能使LPS更加均勻地分布于小鼠肺內,顯著增加LPS與肺組織的有效接觸面積,引起更強烈的炎癥放大反應,造成更嚴重的肺組織損傷,從而更接近ALI病理過程,

36、而且氣管內霧化LPS具有手術創(chuàng)傷小、操作簡便等特點,是復制ALI小鼠模型的優(yōu)選方案。
   2.給予適當劑量的NBD預處理,可以有效抑制LPS誘導的ALI小鼠肺組織內NF-κB信號通路的正反饋性放大,進而明顯減輕肺組織炎癥反應和氧化應激損傷,保護肺組織結構細胞。
   3.NBD聯(lián)合PS預處理,不僅可以顯著下調炎癥反應信號通路中MAPKs磷酸化水平,抑制NF-κB環(huán)路的正反饋性放大,減少TNF-α和IL-1β等促炎介質表

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論