依達拉奉對脂多糖內(nèi)毒素誘導急性肺損傷大鼠的保護作用及分子機制研究.pdf

1、急性肺損傷(acutelunginjury,ALI)是以肺內(nèi)彌漫性炎癥細胞浸潤、肺組織循環(huán)障礙、肺毛細血管通透性增加及低氧血癥為特征的常見臨床綜合征，預(yù)后差、病情兇險，可迅速進展為多臟器功能衰竭，病死率為30％～70％，防治本類疾病具有非常重要的臨床意義。雖然國內(nèi)外已進行了大量的實驗與臨床研究，但仍未完全闡明ALI病理演變過程及發(fā)病機制，且藥物治療效果不佳，常以小潮氣量保護性機械通氣來降低死亡率。 初步使用的ALI治療藥物有血管

2、舒張劑的吸入治療(一氧化氮吸入、前列環(huán)素吸入及外源性肺表面活性物質(zhì)等)、腎上腺糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥物、酮康唑(ketoconazole)等，但存在療效不滿意或嚴重的不良反應(yīng)等問題，因此，迄今尚無強力的、安全有效的藥物治療手段。 目前對有關(guān)中性粒細胞肺內(nèi)扣押、過度激活及導致肺微血管通透性增高的機制和相應(yīng)信號調(diào)控機制的早期藥物干預(yù)正成為尋找ALI抗炎治療藥物的重要手段。研究認為，氧自由基(Oxygenfreeradicals，

3、OFR)損傷是中性粒細胞聚集、跨膜遷徒、活化后引起肺實質(zhì)和肺微血管損害等過度失控的炎癥反應(yīng)的最主要機制之一。抗氧化劑逐步納入我們的視線。ALI時，活化的中性粒細胞和肺泡巨噬細胞以及肺泡上皮細胞產(chǎn)生超大量的活性氧類，包括羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫等，導致蛋白核酸變性和生物膜破壞，并且促使更進一步中性粒細胞聚集而導致肺損傷的惡性進展。 依達拉奉(edaravone，MCI-186)，化學名：3-甲基-1-苯基-吡唑啉-5-酮(3

4、-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)，是日本三菱制藥公司研發(fā)，2001年6月在日本上市，迄今為止，依達拉奉是全球進入三期臨床使用的最新型強抗氧化劑，具有強大的自由基清除作用，臨床已經(jīng)有效用于治療急性腦梗塞。近來動物研究發(fā)現(xiàn)，依達拉奉能降低毛細血管壁的通透性、改善微循環(huán)、具有強大的細胞保護作用及抑制溶酶體的釋放等抗炎效應(yīng)，提示著依達拉奉可能具有治療ALI的作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)依達拉奉對ALI模型保護作用的病

5、理生理和分子機制多層面綜合研究報道。因此，本研究將選用脂多糖內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導ALI大鼠在體模型，擬從整體的病生指標、分子水平綜合性將新型抗氧化藥物依達拉奉對ALI的保護作用及機制進行研究，旨在從抗氧化藥物途徑上為依達拉奉治療ALI提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。 本研究的第一、第二章主要從肺部炎癥反應(yīng)的病理形態(tài)學、肺氣體交換能力、肺組織通透性、中性粒細胞活化扣押、氧化/抗氧化系統(tǒng)指標、肺毛細血管內(nèi)皮細

6、胞的超微結(jié)構(gòu)等角度，多角度驗證新型抗氧化劑依達拉奉是否對ALI具有保護作用?；诤艘蜃应蔅(nuclearfactorofκB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導路徑在ALI發(fā)病機制中的重要作用和密切關(guān)系，我們研究的第三、第四章主要從分子水平來驗證新型抗氧化劑依達拉奉對ALI的保護作用是否與抑制MAPK信號通路上的關(guān)鍵蛋白MAPK的三個家族成員p38MAPK

7、、JNK(c-JunN-terminalkinase)、ERK(extracellularsignal-regulatedkinase)蛋白激酶和NF-κB信號通路的關(guān)鍵蛋白NF-κB的活化相關(guān)。 LPS誘導ALI模型的制作和分組：依據(jù)參考文獻和預(yù)實驗來確定和驗證ALI模型的制作，選擇雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(II級清潔等級)，從尾靜脈迅速推注LPS(5mg/kg)，使氧和指數(shù)<300，6小時后配置10％水合

8、氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉后再行進一步操作。依據(jù)隨機數(shù)字表將入選的SD大鼠分成6組(每組8只)：(1)正常對照組(A組)；(2)LPS致傷組(B組)；(3)LPS+Edaravone高劑量組(C組)；(4)LPS+Edaravone中劑量組(D組)；(5)LPS+Edaravone低劑量組(E組)；(6)陽性對照LPS+地塞米松(DEX)組(F組)。B、C、D、E、F組大鼠各依照參考文獻制作ALI模型；正常對照的A組經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水，余組皆

9、注入LPS(5mg/kg)，此外，在LPS注入得前30分，LPS造模的B組注射等容積的生理鹽水；C組注射等容積的Edaravone溶液(3.0mg/kg)；D組注射等容積的Edaravone溶液(1.0mg/kg)；E組注射等容積的Edaravone溶液(0.3mg/kg)；F組注射等容積的DEX溶液(3mg/kg)。 目的： 探討依達拉奉對脂多糖內(nèi)毒素誘導ALI大鼠的保護作用及分子機制，旨在從新的抗氧化藥物途徑上為治療

10、ALI提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。 方法： 第一章依達拉奉對脂多糖內(nèi)毒素誘導急性肺損傷大鼠的保護作用及病生機制分析：測定多項動脈血氣指標，肺通透性指數(shù)(lungpermeabilityindex，LPI)、肺含水量、濕/干重(wettodryweightratio，W/D)比值及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中蛋白含量，光鏡、電鏡觀察肺組織病理形態(tài)變化。 第二章依達拉奉對

11、脂多糖內(nèi)毒素急性肺損傷中性粒細胞肺內(nèi)扣押與氧自由基損傷的抑制作用：測定各組支氣管肺泡灌洗液(BALF)中性粒細胞(polymorphonuclearleukocytes，PMN)計數(shù)比例，測定肺組織、血清中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，S

12、OD)活性。 第三章依達拉奉對脂多糖內(nèi)毒素誘導急性肺損傷大鼠肺組織NF-κB活性的影響：采用蛋白免疫印跡法(Lowry法和Westernblot法)檢測肺組織磷酸化NF-κB的表達。 第四章依達拉奉對脂多糖內(nèi)毒素誘導急性肺損傷大鼠肺組織MAPKs(p38，JNK，ERK)活性的影響：采用蛋白免疫印跡方法(Lowry法和Westernblot法)分三節(jié)分別測定肺組織磷酸化p38MAPK、JNK、ERK的表達。 結(jié)果

13、： 第一章：依達拉奉能顯著降低ALI大鼠動脈血PaCO2值、肺通透性指數(shù)、肺水含量、肺濕/干重比值、BALF中的蛋白含量(P<0.05)，提高ALI大鼠動脈血PaO2值、氧和指數(shù)及PH值(P<0.05)，并顯著減輕ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷，改善肺部炎癥病理改變，依達拉奉對內(nèi)毒素誘導ALI大鼠保護作用呈一定得劑量-效應(yīng)關(guān)系。 第二章：依達拉奉顯著降低ALI大鼠支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞計數(shù)、肺組織中丙二醛含量、髓過氧

14、化物酶活性和血清中丙二醛含量、乳酸脫氫酶活性，顯著提高肺組織和血清中的超氧化物歧化酶活性(P<0.01，或P<0.05)，并且，依達拉奉對內(nèi)毒素誘導急性肺損傷氧自由基損傷和中性粒細胞肺內(nèi)扣押的抑制作用呈一定得劑量-效應(yīng)關(guān)系。 第三章：LPS誘導ALI模型組大鼠的肺組織磷酸化NF-κB的表達比正常對照組顯著升高(P<0.01)，而與LPS誘導ALI模型組比，依達拉奉高、中劑量組能顯著抑制大鼠肺組織磷酸化NF-κB的表達(P<0.0

15、1及P<0.05)，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。 第四章：LPS誘導ALI模型組大鼠的肺組織磷酸化p38MAPK、JNK、ERK的表達比正常對照組顯著升高(P<0.01)，與LPS誘導ALI模型致傷組相比，依達拉奉高劑量組和中等劑量組均能顯著抑制大鼠肺組織磷酸化p38MAPK、JNK,ERK的表達(P<0.01和P<0.05). 結(jié)論： 依達拉奉能減輕LPS誘導ALI微血管屏障破壞，提高肺部氣體交換功能，強力抑制ALI的

16、肺部炎癥反應(yīng)和通透性增高；能發(fā)揮出抑制ALI中性粒細胞肺內(nèi)扣押、聚集及減輕繼發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的嚴重損害，迅速扭轉(zhuǎn)氧化/抗氧化平衡系統(tǒng)的失調(diào)；從分子機制分析，依達拉奉對LPS誘導ALI的保護作用與依達拉奉抑制LPS誘導NF-κB的過度活化存在密切聯(lián)系；同時，依達拉奉也參與阻斷ALI炎癥反應(yīng)另一信號轉(zhuǎn)導途徑-MAPKs的三個關(guān)鍵蛋白激酶(P38MAPK,ERK和JNK)的磷酸化，從炎癥鏈的上游瓶頸處阻斷ALI炎癥級聯(lián)反應(yīng)的激化和繼發(fā)性