sRAGE對脂多糖介導的小鼠急性肺損傷的作用.pdf

1、急性肺損傷(Acute Lung Injury, ALI)及其嚴重表現(xiàn)--急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)是威脅生命的嚴重疾患，臨床上以膿毒癥引起的內(nèi)毒素肺損傷最為常見。針對膿毒癥早期炎癥介質(zhì)釋放，人們嘗試應用各種抗炎性因子治療，但其較高的發(fā)病率與病死率一直無法得到有效控制。近年來，高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)作為

2、內(nèi)毒素/脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)致死效應的重要晚期因子備受關(guān)注，新近研究表明，即使在“早期”炎癥介質(zhì)釋放之后應用抗HMGB1抗體，仍可對致命性急性肺損傷動物發(fā)揮保護作用，這為臨床治療提供了更寬的時間窗。 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation End-Products，PAGE)是介導HMGB1細胞因子活性的重要受體。除了HMGB1，其配體還包括糖基化

3、終末產(chǎn)物、β淀粉樣肽、S100蛋白等。RAGE與其配體相互作用常導致快速持續(xù)的細胞活化和下游基因轉(zhuǎn)錄，多種細胞信號ERK1/2(p44/p42)、p38 andSAPK/JNK MAP kinases，rho-GTPases，phosphoinositol-3-kinase，and the JAK/STAT在不同類型細胞中被激活，并通過核因子-kappaB(Nuclear Factor-kappaB，NF-кB)持久活化維持和擴大炎癥反

4、應。有報道指出，RAGE敲除小鼠能耐受盲腸結(jié)扎穿孔引起的感染性休克，表明RAGE在系統(tǒng)性急性炎癥過程中發(fā)揮重要作用。 最近，在人類和小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)幾種RAGE的變異體，公認的有可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)和內(nèi)源性分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE，esRAGE)。雖然它們的產(chǎn)生機制及分子大小不盡相同，但由于都包括配體結(jié)合的細胞外區(qū)域而缺乏跨膜區(qū)域，因此能與RAGE競爭同RA

5、GE配體的結(jié)合，并阻斷RAGE信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導。體內(nèi)外研究證實，應用sRAGE對糖尿病血管病變、創(chuàng)口延遲愈合、遲發(fā)型高敏反應、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎等多種炎癥性疾病動物模型具有保護作用。揭示sRAGE在內(nèi)毒素致傷后的肺內(nèi)表達，論證其對急性肺損傷的作用及機制有助于對RAGE通路的理解并為以RAGE為靶點的治療方向奠定理論基礎。目前國內(nèi)外關(guān)于RAGE的研究以慢性炎癥性疾病為主，已取得重大進展，但急性炎癥相關(guān)報道罕見，關(guān)于急性肺損傷與RAGE的干預研

6、究更是空白。為明確RAGE及其變異體在內(nèi)毒素肺損傷發(fā)病中的作用，我們建立小鼠LPS肺損傷模型，觀察LPS氣管內(nèi)滴注后肺內(nèi)RAGE及其變異體在蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化；通過sRAGE干預驗證其是否對LPS介導的肺損傷發(fā)揮保護作用；并從炎癥與凋亡兩方面評價sRAGE肺損傷保護作用的機制，從而為感染相關(guān)性肺損傷的防治開辟新的前景。 方法: (1)小鼠脂多糖肺損傷模型的建立C57BL/6J小鼠，8-11周齡，體重18-22g，

7、腹腔注射鹽酸氯胺酮(100mg/kg體重)和賽拉嗪(10mg/kg體重)麻醉后，經(jīng)頸正中切口游離氣管，以24G套管針行氣管穿刺，將套管插入左主支氣管，向左肺內(nèi)注入3mg/kg體重的E．coli LPS(濃度為1.2mg LPS/ml PBS)，對照組(PBS組)用相同體積的磷酸鹽緩沖鹽水(Phosphate-buffered saline，PBS)代替LPS氣管內(nèi)注入。 (2)LPS氣管內(nèi)注入后不同時點采集肺組織標本，于24h收

8、集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)，用蛋白印記(Western blot)方法分析各時點肺組織勻漿及LPS滴入后24h BALF中RAGE及其變異體蛋白的表達；應用實時定量聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)檢測各時點肺組織中RAGE mRNA和esRAGE mRNA的表達。 (3)LPS氣管內(nèi)注入后1h，sRAGE組小鼠接受100

9、ug sRAGE(溶于100ul PBS中)腹腔注射，LPS組在相同時點接受100ul PBS腹腔注射，PBS組于氣管內(nèi)滴注PBS后1h給與100ul PBS腹腔注射。三組動物于氣管滴注后24h經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(250mg/kg體重)處死，采集BALF及肺組織，比較氣管滴注24h后組間BALF中白細胞計數(shù)，白細胞介素-1β(Interleukin，IL-1β)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Fa

10、ctor-α，TNF-α)、巨噬細胞炎癥蛋白(Macrophage InflammatoryProtein，MIP-1α)、MIP-1β、單核細胞趨化蛋白-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)、角質(zhì)細胞起源趨化因子(Keratinoeyte-derived Chemokine，KC)8種細胞因子水平(Bio-Plex技術(shù))及肺組織病理學(H．E．染色)表現(xiàn)。 (4)為探討sRA

11、GE對脂多糖引起的肺內(nèi)NF-кB活化的影響，快速采集上述三組動物LPS注入后4h的肺組織，分離核提取物，應用BD<'TM> TransFactor Chemiluninescent試劑盒分析核提取物中NF-кB P65 DNA結(jié)合活性作為評價NF-кB活化的指標。應用末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated-dUTP nick end labeling

12、，TUNEL)及激光共聚焦顯微鏡對上述三組動物LPS注入后24h肺組織石蠟切片行細胞凋亡原位檢測，比較各組TUNEL陽性細胞數(shù)量。 (5)統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，應用SPSS14.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析和學生t檢驗，各組間差異用最小顯著差法進行Post Hoc檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: 1、RAGE及其變異體在LPS肺損傷小鼠肺內(nèi)的表達應用抗RAGE細胞外區(qū)域的特異性抗體行W

13、estern blot檢測，發(fā)現(xiàn)RAGE蛋白在未經(jīng)處置的0h組小鼠肺組織勻漿中呈現(xiàn)三條條帶，分子量分別約為54kD，48kD和38kD。LPS注入后6、12和24h，三條條帶強度均無明顯變化。相比之下，BALF中只檢測到分子量約48kD的單一條帶，氣管內(nèi)滴注PBS后24h，該條帶表達較弱，滴注LPS后24h，該條帶密度顯著增強(P<0.05)。 實時定量PCR檢測表明，LPS氣管內(nèi)滴注后6h，肺內(nèi)RAGE mRNA表達顯著下降，

14、此后6h、12h、24h呈逐漸下降趨勢，各時點與Oh(未處置小鼠)相比均具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。相比之下，LPS注入后各時點esRAGE mRNA無顯著變化(P>0.05)。 2、sRAGE干預對LPS介導的急性肺損傷的影響與PBS組相比，滴注LPS后24h小鼠BALF中白細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)均明顯增多(P<0.01)；LPS后1h腹腔注射sRAGE的小鼠比腹腔注射PBS的小鼠24h BALF中自細胞總數(shù)及中性粒細

15、胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)。與PBS組相比，小鼠氣管內(nèi)滴注LPS 24h后BALF中8種細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1 and KC)濃度均顯著增高(P<0.01)；LPS滴注后1h腹腔注射sRAGE的小鼠比腹腔注射PBS的小鼠24h BALF中TNF-α、MIP-1α和MIP-1β水平明顯降低(P<0.05)，但兩組間其他5種細胞因子水平未見顯著性差異(P>0.05)

16、。 光鏡下觀察H．E染色肺組織切片發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)滴注后24h，PBS組肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見明顯中性粒細胞浸潤和間質(zhì)水腫。LPS組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)大量中性粒細胞聚集，伴有明顯肺泡壁增厚、肺泡毛細血管充血滲出，部分肺泡萎陷。sRAGE組肺內(nèi)中性粒細胞浸潤較LPS組明顯減輕，肺泡壁充血水腫也明顯緩解。 3、sRAGE對LPS介導的肺內(nèi)NF-кB活化和細胞凋亡的影響LPS氣管內(nèi)滴注后4h，肺內(nèi)NF-кB p65 DNA結(jié)合活性

17、較PBS組明顯增強(P<0.01)，LPS后1h sRAGE腹腔注射顯著抑制了LPS引起的NF-кB活化(P<0.05)。競爭分析證實了NF-кB與DNA的特異性結(jié)合。 TUNEL檢測顯示，氣管內(nèi)滴注后24h，PBS組僅有個別肺泡上皮細胞核呈現(xiàn)綠色熒光的陽性染色，LPS組陽性細胞數(shù)顯著增多(與PBS組比較P<0.01)，sRAGE組陽性細胞數(shù)比LPS組明顯減少(P<0.05)。 結(jié)論: (1)RAGE及其變異體在

18、正常肺組織中表達豐富，脂多糖刺激引起其可溶性變異體向肺泡腔內(nèi)釋放增多。由全長RAGE蛋白水解導致C-末端截斷形成sRAGE是脂多糖介導的肺泡腔中可溶性RAGE變異體的可能來源。 (2)應用sRAGE阻止RAGE信號可抑制脂多糖引起的小鼠肺內(nèi)中性粒細胞聚集、致炎細胞因子產(chǎn)生和肺組織病理改變，對脂多糖介導的急性肺損傷具有保護作用。 (3)sRAGE抑制脂多糖引起的NF-кB活化和肺泡上皮凋亡，通過抗炎和抗凋亡雙重機制對脂多糖