解偶聯(lián)蛋白2在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　急性肺損傷(acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)是臨床常見的危重癥，雖然已經(jīng)對ALI/ARDS進行了長期的研究，但目前仍缺乏有效的治療手段，病死率仍高達30～40％。ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展是全身失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，病理特征包括中性粒細胞聚集，肺泡-毛細血管的損傷和通透性增加，肺內(nèi)大量蛋白和炎癥因子滲出。

2、線粒體在肺泡上皮損傷中發(fā)揮著重要作用，參與了細胞凋亡信號通路，如調(diào)節(jié)活性氧生成、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)平衡，穩(wěn)定線粒體膜電位，或控制鈣穩(wěn)態(tài)。此外，研究表明，線粒體和炎癥反應(yīng)的相互作用在炎癥性疾病中占有重要地位，但兩者在急性肺損傷發(fā)病機制中的作用尚不清楚。
　　解偶聯(lián)蛋白(Uncoupling proteins，UCPs)是位于線粒體內(nèi)膜的陰離子質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員，調(diào)控免疫應(yīng)答和炎癥反

3、應(yīng)，目前在人類中共發(fā)現(xiàn)5種亞型，分別命名為UCP1～5，其中UCP2是研究得較早較多的解偶聯(lián)蛋白，目前發(fā)現(xiàn)UCP2在心臟、腦、肝臟等器官的炎癥損傷中發(fā)揮了重要作用。已有文獻報道在系統(tǒng)性炎癥和感染的患者體內(nèi)UCP2表達增加，與患者的死亡率存在相關(guān)性。急性肺損傷是全身失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，因此UCP2可能成為急性肺損傷治療的潛在靶點。但UCP2在急性肺損傷中的作用尚未見文獻報道，本研究探討了UCP2在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型炎癥損傷中

4、的作用及機制。
　　本研究構(gòu)建了過表達UCP2的腺病毒載體，體內(nèi)轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠，上調(diào)小鼠肺組織UCP2的表達;通過京尼平下調(diào)UCP2的表達。在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中，通過Western Blot(WB)、免疫組化檢測腺病毒在小鼠肺組織中UCP2的表達情況;觀察UCP2對肺組織病理改變和肺泡-毛細血管屏障通透性、細胞因子、細胞凋亡的影響;線粒體功能的改變;MAPK、NF-κB通路的激活情況，探討UCP2在ALI/A

5、RDS發(fā)生、發(fā)展中的作用，為ALI/ARDS的防治提供新的靶點和方向。
　　方法:
　　(1) UCP2過表達慢病毒載體的構(gòu)建
　　分離小鼠外周血單個核細胞提取總RNA，RT-PCR擴增小鼠UCP2 cDNA，將其亞克隆至病毒穿梭載體PYr-adshuttle-1進行DNA測序鑒定，并轉(zhuǎn)染HEK293細胞進行病毒包裝，獲得重組腺病毒UCP2-Ad。用經(jīng)鼻滴注建立C57BL/6J小鼠腺病毒UCP2-Ad體內(nèi)感染模型，同時

6、使用空病毒載體UCP2-NC作為陰性對照，通過免疫組化、WesternBlot檢測UCP2在肺組織的表達情況。
　　(2)觀察UCP2對急性肺損傷小鼠炎癥損傷的影響
　　腺病毒轉(zhuǎn)染后第3d腹腔注射LPS(15 mg/kg)建立急性肺損傷小鼠模型。LPS處理前使用京尼平預(yù)處理，抑制肺組織UCP2的表達。ALI后24 h處死小鼠，檢測小鼠肺組織病理改變、肺水腫程度、支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子含量，探討UCP2對肺組織炎癥損傷的影

7、響;通過Western Blot檢測cleaved caspase3表達、細胞色素C的釋放和Bcl-2家族蛋白在各組小鼠肺組織的表達，TUNEL檢測肺泡細胞凋亡情況，探討UCP2對肺泡上皮細胞凋亡的影響。
　　(3)觀察UCP2對急性肺損傷后MAPK和NF-κB通路的影響
　　進一步觀察UCP2對急性肺損傷后促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影響，通過Western Blot檢測p38 MAPK、Jun氨基末端激酶(Ju

8、n N-terminal kinase，JNK)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的激活情況，ELISA檢測炎癥因子的水平，并分別給予p38 MAPK特異性抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125或ERK抑制劑PD98059，觀察UCP2對MAPK信號通路和下游炎癥因子的影響，并明確哪一條MAPK信號通路參與了UCP2調(diào)控的肺部炎癥損傷。觀察京尼平對MA

9、PK信號通路的影響，進一步證實京尼平通過哪條信號通路保護LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。此外，觀察UCP2和京尼平對NF-κB信號通路的影響，并通過檢測ATP水平和5'-AMP激活性蛋白激酶(5'-AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路的激活情況明確其調(diào)控機制。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建了過表達UCP2的腺病毒載體UCP2-Ad和對照空載病毒UCP2-NC。通過免疫組化和Western B

10、lot證實腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染可以顯著增加肺組織UCP2的表達(P＜0.05)，主要表達于肺泡細胞。UCP2-Ad感染滴度為5×108 pfu/鼠，最佳感染時間為3d，并且通過病理學(xué)檢測證實腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染不會引起肺組織炎癥反應(yīng)。
　　(2)UCP2表達于正常小鼠肺組織，LPS處理后UCP2的表達顯著增加(P＜0.05);UCP2過表達可顯著加重LPS引起的肺組織病理改變、增加炎癥細胞浸潤、肺組織出血，增加肺組織濕干重比(P＜0.05)，

11、促進肺水腫;增加炎癥因子TNF-、IL-1β的表達(P＜0.05);降低急性肺損傷小鼠的存活率(P＜0.05)。此外，UCP2加重肺泡細胞線粒體功能不全，減少ATP生成，增加促凋亡蛋白Bax的表達，促進細胞色素C釋放，增加激活型caspase3的表達，TUNEL陽性細胞顯著增加，促進細胞凋亡(P＜0.05)。相反，京尼平抑制UCP2的表達可以顯著減輕急性肺損傷后肺組織的炎癥損傷和細胞凋亡。
　　(3) UCP2促進了肺損傷后MAP

12、K通路p38 MAPK、JNK、ERK的激活，促進TNF-α、IL-1β的釋放。P38、JNK抑制劑能顯著抑制UCP2誘導(dǎo)的細胞凋亡和炎癥因子釋放，但ERK抑制劑沒有作用，結(jié)果提示UCP2可能是通過p38 MAPK、JNK通路，而不是通過ERK通路促進肺組織炎癥損傷和細胞凋亡。此外，UCP2通過抑制ATP水平激活A(yù)MPK通路，進而激活了NF-κB。UCP2抑制劑京尼平可以顯著抑制p38MAPK、JNK、NF-κB通路的激活、細胞凋亡和炎