緊密連接蛋白在脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織的表達(dá).pdf

1、急性肺損傷(ALI)是由各種肺內(nèi)外致病因素引起的急性進(jìn)行性呼吸衰竭。主要病理特征是彌漫性肺泡毛細(xì)血管膜損傷、通透性增高和肺水腫。目前國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為肺泡-毛細(xì)血管膜通透性增高是其主要發(fā)病機(jī)制。內(nèi)毒素直接或間接損傷肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管膜通透性增加。肺毛細(xì)血管內(nèi)皮的孔徑是肺泡上皮孔徑的約4倍即肺泡上皮較肺毛細(xì)血管內(nèi)皮更為致密，故研究肺泡上皮屏障有著更為重要的意義。TJ主要存在于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體中形成環(huán)繞

2、細(xì)胞的物理屏障結(jié)構(gòu)。重要的TJ有Zo-1和閉鎖蛋白(Occludin)等。目前國內(nèi)尚無關(guān)于ALI時緊密連接蛋白損傷的研究報道。我們探討內(nèi)毒素引起肺泡上皮細(xì)胞Zo-1和Occludin蛋白表達(dá)變化規(guī)律，以推測緊密連接蛋白在ALI發(fā)生中的可能機(jī)制，并為早期ALI治療提供理論依據(jù)。 材料與方法： 一、實驗材料 1、實驗動物： SD(Sprague-Dawley)大鼠，雄性，體重220～270g，共30只。

3、 2、主要試劑： LPS：E.coli，內(nèi)毒素055：B5 LPS；購于Sigma.Co。一抗：山羊抗鼠Occludin多克隆抗體，山羊抗鼠Zo-1多克隆抗體，美國Santa Cruz公司。二抗：兔抗山羊抗體，胃蛋白酶，DAB顯示劑。免疫組化試劑盒包括正常血清封閉液。源于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 3、主要器材： 電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9262型。源于上海精宏實驗設(shè)備有限公司．微波爐： WD-70

4、0型。源于LG電子天津電器有限公司。顯微鏡：CX-41RF型。源于菲律賓。顯微圖像分析系統(tǒng)：Meta Morph/DP10/BX41，由UIC/OLYMPUS，US/JP生產(chǎn)。多道生理信號采集處理系統(tǒng)RM 6240 BD型源于成都儀器廠制造。 二、實驗方法 1、實驗動物分組及動物模型制備：30只SD雄性大鼠，隨機(jī)分成3組：正常對照組，LPS4h組，LPS24h組，每組10只大鼠。10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射

5、麻醉大鼠后，暴露氣管，實驗組氣管內(nèi)滴注LPS 0.5ml/kg(濃度為 LPS 200μg/ml)，對照組氣管內(nèi)滴注NS 0.5ml/kg。LPS給予后觀察4h組為LPS4h組，觀察24h組為LPS24h組，NS對照組觀察24h。 2、實驗動物的觀察和標(biāo)本的采集：當(dāng)大鼠觀察結(jié)束時，分別用10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉。分離頸動脈，用套管針進(jìn)行頸動脈插管。經(jīng)壓力換能器與多道生理信號采集處理系統(tǒng)相連，記錄血壓。然后，暴露

6、氣管并開胸，觀察肺形態(tài)。在左心耳處剪約2mm小切口，于右室經(jīng)肺動脈流出道插入肺動脈套管針，灌注加入肝素的生理鹽水，直至將肺血管床沖洗干凈，肺組織潔白。將左主支氣管結(jié)扎，取左下肺組織(約1cm×1cmx0.5cm)浸泡固定于4％多聚甲醛中24h，常規(guī)脫水、包埋、制成蠟塊，用于HE染色及免疫組化染色。余下的左肺組織稱濕重(W)后置60℃溫箱，7天后稱干重(D)，求得濕重/干重比(W/D)。 3、肺組織常規(guī)病理分析：肺組織臘塊切成4μ

7、m切片后經(jīng)不同濃度酒精梯度常規(guī)脫蠟至水，HE染色。 4、Occludin，Zo-1在肺組織中的免疫組化染色：肺組織蠟塊切成4μm切片后嚴(yán)格按免疫組化試劑盒說明書操作。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替第1抗體作為陰性對照。結(jié)果通過圖像分析，測出Occludin，Zo-1表達(dá)的平均灰度A。 三、統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料采用-x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析及q檢驗，p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 結(jié)

8、果一、肺組織的病理改變NS對照組：肺臟大體觀察無明顯異常改變。光鏡可見肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病變。LPS4h組和LPS24組：大體觀察可見所有肺組織均有腫脹，肺表面色澤暗紅。光鏡可見肺泡腔內(nèi)有明顯的中性粒細(xì)胞浸潤及少量的紅細(xì)胞滲出。LPS4組較LPS24h組肺泡間隔增厚，有更多紅細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤。 二、肺組織濕重/干重(W/D)及血壓 肺W/D表明肺損傷4h組大鼠(6.65±0.58)與對照組(4.50±0.42)相比

9、出現(xiàn)明顯的差異(p<0.05)，肺損傷24h組(4.82±0.55)與對照組相比無明顯差異(p>0.05)。說明肺損傷4小時組肺水腫最明顯。LPS給予后血壓均低于對照組，以肺損傷4h組血壓(64±6.0)下降最明顯與對照組(96±5.0)相比具有顯著差異(p<0.05)；肺損傷24h組血壓(85±6.0)與對照組無明顯差異(p>0.05)。 三、Occludin在肺組織中的表達(dá) Occludin在正常對照組大鼠肺泡上皮細(xì)

10、胞大量表達(dá)呈棕黃色。Occludin表達(dá)在LPS4h組(20.5±3.68)明顯減弱與對照組(40.97±8.01)相比具有顯著差異(p<0.05)。Occludin表達(dá)在LPS24h組(32.77±3.40)與LPS4h組相比有所恢復(fù)但與對照組相比仍有顯著差異(p<0.05)。 四、Zo-1在肺組織中的表達(dá) Zo-1在正常對照組大鼠肺泡胞漿大量表達(dá)呈棕黃色。肺泡胞漿Zo-1表達(dá)在LPS4h組(20.77±5.08)明顯