急性胰腺炎大鼠腸道緊密連接損傷及其與αSNAP表達(dá)的關(guān)系.pdf

1、研究背景與目的:
　　急性胰腺炎是臨床常見(jiàn)的急腹癥,重癥患者胰腺局部損傷的同時(shí)往往伴發(fā)肺、肝臟、心臟、腸道等多器官功能障礙綜合征(MODS)。腸道是疾病進(jìn)展過(guò)程中最易受累的胰外器官之一,亦可能是MODS發(fā)生的啟動(dòng)者。目前,腸屏障損傷在重癥急性胰腺炎中所發(fā)揮的作用受到廣泛關(guān)注。腸黏膜屏障一般由免疫屏障、機(jī)械屏障、生物屏障和化學(xué)屏障四部分組成。腸機(jī)械屏障的主要構(gòu)成蛋白之一(occludin)受多種因素調(diào)節(jié)。ɑSNAP是一種新型的膜融合

2、蛋白,在腸上皮細(xì)胞中表達(dá)豐富,參與調(diào)節(jié)腸屏障的形成與重塑過(guò)程。本的研究目的在于檢測(cè)急性胰腺炎大鼠模型中腸屏障損傷情況,以及occludin表達(dá)的變化,并探討其與ɑSNAP表達(dá)的關(guān)系。
　　方法:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　SD大鼠72只,隨機(jī)分為三組,分別逆行胰膽管注射生理鹽水、0.5％牛黃膽酸鈉溶液、3.8%牛黃膽酸鈉溶液后制作成SO、MAP、SAP組模型。在1d、2d、3d后通過(guò)HE染色觀察大鼠胰腺以及回腸上皮的病理變

3、化。采用酶化學(xué)方法檢測(cè)血清淀粉酶, ELISA方法檢測(cè)血清 TNF-ɑ、內(nèi)毒素水平變化,。通過(guò)檢測(cè)漏出腸道的 FITC-dextran量間接反映腸道通透性的變化。occludin和ɑSNAP的分布及表達(dá)變化采用免疫熒光和免疫印跡(western blot)方法檢測(cè)。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　構(gòu)建ɑSNAP shRNA慢病毒載體、轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后IEC-6細(xì)胞凋亡;western blot和免疫熒光

4、檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后IEC-6細(xì)胞occludin的表達(dá)和分布變化。
　　結(jié)果:
　　1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1)SAP組大鼠血清淀粉酶、TNF-α、內(nèi)毒素水平明顯升高。在1d、2d、3d時(shí)血清淀粉酶水平:SO組(1243.75±157.88,1182.5±153.09,1008.13±73.29);MAP組(1662.5±104.68,2326.25±300.03,2325±200.48); SAP組(7897.5±1006.29

5、,5947.5±554.69,5104.38±1256.31)。在1d、2d、3d時(shí)血清TNF-ɑ水平:SO組(11.59±5.55,17.64±5.75,14.11±4.83);MAP組(55.43±9.62,86.77±22.31,38.26±10.93);SAP組(174.76±35.50,203.96±60.54,119.02±29.20)。在1d、2d、3d時(shí)血清內(nèi)毒素水平:SO組(9.53±7.92,8.87±4.05,8.

6、65±5.03);MAP組(54.36±11.43,67.98±8.86,88.97±9.06);SAP組(208.15±24.47,197.51±22.99,137.18±31.70)。各組間比較p<0.05。
　　2)胰腺組織病理:SO組胰腺組織無(wú)明顯變化;MAP組胰腺組織可見(jiàn)輕度水腫,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);SAP組胰腺組織大片壞死、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。在1d、2d、3d時(shí)胰腺病理評(píng)分分別為:SO組(1.88±0.34,2.09±0

7、.26,2.00±0.68); MAP組(4.86±0.61;5.06±0.59;5.35±0.62); SAP組(10.63±0.51;12.95±0.39;13.91±0.45)。各組間比較p<0.05。
　　3)空腸上皮組織病理:SO組空腸組織絨毛形態(tài)正常;MAP組腸絨毛輕微縮短,其他未見(jiàn)明明改變;SAP組腸絨毛出現(xiàn)明顯水腫、倒伏、萎縮,腸上皮細(xì)胞壞死、脫落。在1d、2d、3d時(shí)空腸上皮組織病理評(píng)分分別為:SO組(1;1;1

8、); MAP組(1.500±0.54;1.88±0.35;2.13±0.64); SAP組(3.38±0.52;4.13±0.84;5.13±0.84)。各組間比較p<0.05。
　　4)急性胰腺炎大鼠腸道通透性明顯升高,漏出腸道的 FITC-dextran的熒光值:SO組(1d,11.08±4.22;2d,8.31±1.74;3d,16.50±8.83),MAP組(1d,75.39±34.40;2d,123.50±5.09;3d

9、,66.11±9.48),SAP組(1d,379.34±25.38;2d,586.52±57.35;3d,489.76±105.36)。各組間比較p<0.05。
　　5)SO、MAP組大鼠腸上皮細(xì)胞occludin和αSNAP蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化;SAP組大鼠腸上皮細(xì)胞occludin和αSNAP表達(dá)明顯下調(diào)。
　　2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　ɑSNAP shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后IEC-6細(xì)胞凋亡明顯增加;occludin表達(dá)明顯下