大鼠急性胰腺炎與慢性胰腺炎早期階段代謝特征比較分析.pdf

1、第一部分大鼠急性胰腺炎、慢性胰腺炎動(dòng)物模型的建立
　　 目的：建立在病因、致病機(jī)制等方面與臨床急性壞死型胰腺炎相似的大鼠急性胰腺炎模型，用于急性胰腺炎生物學(xué)特性及代謝特征研究。建立與人類慢性胰腺炎病程極其相似的大鼠慢性胰腺炎模型，用于慢性胰腺炎進(jìn)程及其代謝特征的研究。
　　 方法：(1)大鼠急性胰腺炎模型制作：雄性WISTA大鼠40只，體重約180-200g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組再分6、12、24、48h4個(gè)觀察

2、時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5個(gè)大鼠。試驗(yàn)組大鼠腹腔內(nèi)分次大劑量注射L-精氨酸，(2×2.5 mg/g)，中間間隔一小時(shí)后再注射。對(duì)照組僅注射同等劑量的生理鹽水。造模6、12、24、48h后開腹經(jīng)心臟取血，檢測血清淀粉酶，觀察血清淀粉酶動(dòng)態(tài)變化。剝離胰腺組織，大體觀察后小部分用于病理研究，大部分液氮固定備用。
　　 (2)大鼠慢性胰腺炎模型制作：雄性WISTA大鼠60只，體重約180-200g,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白組，每組再分1、8、1

3、5、21、28、60天6個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)。二丁基二氯化物(DBTC)先溶于100％酒精，再溶于甘油(三者的比例為1∶2∶3)。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尾靜脈注入DBTC溶液，劑量為8mg/kg大鼠體重，對(duì)照組僅注等量溶劑。造模1、8、15、21、28、60天后開腹經(jīng)心臟抽取血液標(biāo)本，測定血清淀粉酶、脂肪酶、透明質(zhì)酸含量。小心剝離胰腺組織，部分胰腺組織送至病理科，行HE染色并觀察不同時(shí)期組織病理學(xué)變化，由2位資深病理學(xué)專家采用雙盲法評(píng)定炎癥分級(jí)。應(yīng)用改良Va

4、n Gieson膠原纖維染色法觀察胰腺組織纖維化程度改變。
　　 結(jié)果：急性胰腺炎組大鼠在注射L-精氨酸后6、12、24、48h死亡數(shù)分別為1、0、1、1.總病死率為7.5％。將各時(shí)間點(diǎn)存活大鼠麻醉，心臟采血后處死。大體觀察發(fā)現(xiàn)，造模后6h，胰腺組織腫脹伴點(diǎn)狀出血點(diǎn)；12h,胰腺腫脹更加顯著，出血點(diǎn)增多伴輕度液化改變；24h及48h組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)模糊，胰周可見大量脂肪組織。光鏡下觀察：造模后6h胰腺充血水腫明顯，出現(xiàn)少量胰腺

5、壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤；12h胰腺水腫，充血出血、胰腺實(shí)質(zhì)大片凝固性壞死、間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤；24及48h胰腺組織結(jié)構(gòu)模糊，胰周見大量脂肪組織充填。造模后6h血清淀粉酶即明顯增高，12h升高更為明顯,24h升高達(dá)最高峰，48h后開始下降。
　　 慢性胰腺炎組大鼠，大體觀察發(fā)現(xiàn)，造模1天后，胰腺組織輕度水腫，胰管未見明顯擴(kuò)張；8天后胰腺組織水腫加重；15天后胰管可見擴(kuò)張，以胰頭、體側(cè)胰管擴(kuò)張明顯；21天后胰腺組織出現(xiàn)萎縮，表面不規(guī)

6、則、粗糙；60天后胰腺組織明顯萎縮，與周圍組織粘連改變。光鏡觀察，造模1天后，胰腺組織表現(xiàn)為急性輕度間質(zhì)性水腫性胰腺炎，可見散在中性粒細(xì)胞浸潤；8天后炎癥表現(xiàn)加重，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等細(xì)胞廣泛浸潤，腺泡腫脹明顯，可見散在點(diǎn)狀壞死改變；15天后大量炎癥細(xì)胞浸潤，伴輕度纖維化改變，間質(zhì)內(nèi)觀察到少量纖維組織沉積；隨著時(shí)間的延續(xù)21-30天時(shí)，纖維化逐漸加重，可見大量纖維結(jié)締組織沉積；60天后胰腺小葉正常結(jié)構(gòu)破壞，腺泡消失，整個(gè)視

7、野內(nèi)見大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織大量增生，廣泛間質(zhì)纖維化。血液生化表現(xiàn)為造模1天后，血清淀粉酶、脂肪酶及透明質(zhì)酸即明顯升高；8天后血清淀粉酶即恢復(fù)正常水平，脂肪酶15天后恢復(fù)正常水平，透明質(zhì)酸濃度則一直高于對(duì)照組，但沒有明顯規(guī)律，與時(shí)間無明確相關(guān)性。
　　 結(jié)論：通過腹腔內(nèi)分次大劑量注射左旋精氨酸的方法可成功制各出與人急性胰腺炎生物學(xué)特性相似的炎癥模型，適合人類急性胰腺炎基礎(chǔ)研究的需要。采用DBTC尾靜脈注射法建立的大鼠慢性胰腺

8、炎模型，以纖維結(jié)締組織沉積動(dòng)態(tài)改變?yōu)槠渲饕卣鳎c人類慢性胰腺炎演變過程極為相似，能為人類慢性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制、發(fā)病進(jìn)程及治療等研究提供合適的動(dòng)物模型。
　　 第二部分大鼠急性胰腺炎、早期慢性胰腺炎離體組織塊代謝特征比較分析
　　 目的：比較大鼠正常胰腺、急性胰腺炎、早期慢性胰腺炎離體組織塊代謝特征變化，分析其代謝改變與組織病理的相關(guān)性，比較急性胰腺炎與早期慢性胰腺炎代謝特征的差異，為臨床急性與早期慢性胰腺炎的相關(guān)研究奠

9、定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：運(yùn)用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜技術(shù)，(High-resolution Magic AngleSpinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,HRMAS-NMR)，比較大鼠正常胰腺、急性胰腺炎、早期慢性胰腺炎離體組織塊的代謝特征，分析某些特征性代謝物相對(duì)含量的改變與組織病理的關(guān)系。在HRMAS-NMR1H譜解析的基礎(chǔ)上，運(yùn)用主成分分析法(princip

10、al componet analysis，PCA)建立大鼠急性胰腺炎與慢性胰腺炎的特征代謝變量模型，為后期人急性胰腺炎及各階段慢性胰腺炎代謝物特征比較提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)將Wistar大鼠胰腺組織樣品分為正常組、急性胰腺炎組和早期慢性胰腺炎組，正常組5例，急性和慢性胰腺炎組分別6例。所有離體標(biāo)本的HRMAS-NMR實(shí)驗(yàn)均在BRUKER AVANCE-600譜儀上進(jìn)行，魔角轉(zhuǎn)速為5k Hz，測試溫度為300K，一維質(zhì)譜是由預(yù)飽和法和C

11、PMG兩種實(shí)驗(yàn)方法獲得，其中，CPMG脈沖序列中總的自旋回波時(shí)間320ms；同時(shí)，1H譜的波峰指認(rèn)通過二維J分解及JRES、HSQC等降維實(shí)驗(yàn)獲得。由CPMG測得的一維波譜數(shù)據(jù)被用于進(jìn)行小分子化合物的主成分分析，得到了PC1(第一主成分)與PC2(第二主成分)的Scores(得分)圖和Loadings(負(fù)載)圖.
　　 結(jié)果：通過對(duì)Wistar大鼠正常胰腺、急性胰腺炎、早期慢性胰腺炎組織樣品的HRMAS1H磁共振波譜分析，結(jié)合主

12、成分分析法，發(fā)現(xiàn)正常胰腺、急性性胰腺炎和早期慢性胰腺炎組織樣品分別處在Scores圖中的三個(gè)不同區(qū)域，說明三者間有不同的代謝學(xué)特征，并且三者可以區(qū)分開來；Loadings圖表明將正常胰腺、急性胰腺炎、早期慢性胰腺炎區(qū)分開來的主要因素是：?；撬?TAU)3.45-3.35ppm、甜菜堿(BET)3.25-3.20)ppm、磷酸膽堿+甘油磷酸膽堿(3.20-3.18 ppm)、膽堿(CHO)3.18-3.13 ppm、谷氨酸(GLU)2.4

13、0-2.28 ppm、乙酸(ACE)1.93-1.80 ppm、丙氨酸(ALA)1.51-1.40ppm、乳酸(LAC)1.33-1.22 ppm。大鼠急性胰腺炎標(biāo)本與正常胰腺組織相比：?；撬?TAU)、乙酸(ACE)、丙氨酸(ALA)波峰下面積增加；甜菜堿(BET)、磷酸膽堿+甘油磷酸膽堿(PC+GPC)波峰下面積減低；膽堿(CHO)谷氨酸(GLU)、乳酸(LAC)波峰強(qiáng)度未見明顯差異。大鼠早期慢性胰腺炎組織與正常胰腺組織相比較：牛磺

14、酸(TAU)、乳酸(LAC)、磷酸膽堿+甘油磷酸膽堿(PC+GPC)波峰下面積增加；甜菜堿(BET)、膽堿(CHO)、谷氨酸(GLU)、乙酸(ACE)、丙氨酸(ALA)波峰下面積未見明顯變化。與大鼠慢性胰腺炎組相比較，急性胰腺炎組乙酸(ACE)、丙氨酸(ALA)及異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)波峰下面積增加；甜菜堿(BET)、磷酸膽堿+甘油磷酸膽堿(PC+GPC)波峰下面積降低；而牛磺酸(TAU)、膽堿(CHO)

15、、谷氨酸(GLU)、乳酸(LAC)波峰下面積無明顯變化。
　　 結(jié)論：采用HRMAS核磁共振波譜技術(shù)避免了組織萃取溶解等物理化學(xué)處理過程帶入的誤差，并能得到高分辨率譜圖，既提高了圖譜譜峰指認(rèn)的準(zhǔn)確度，同時(shí)降低了統(tǒng)計(jì)分析的誤差。主成分分析法可以將多個(gè)指標(biāo)綜合成幾個(gè)不相關(guān)的獨(dú)立指標(biāo)，更加利于觀察離體標(biāo)本代謝特征與組織病理的相關(guān)性，通過PCA可得到主成分得分圖(scores)及負(fù)載圖(Loadings)，得分圖可以反映類別間的差異，與