低蛋氨酸飲食對(duì)IBD大鼠緊密連接蛋白表達(dá)和功能的影響.pdf

1、炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)存在腸黏膜屏障功能受損，是IBD的潛在致病因素，并增加IBD復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。所以，維持和恢復(fù)腸黏膜屏障功能將有利于提高腸道黏膜的防御功能，維持腸黏膜免疫穩(wěn)定，同時(shí)促進(jìn)腸黏膜修復(fù)有助于維持緩解、減少疾病復(fù)發(fā)。近30年國(guó)內(nèi)外對(duì)低蛋氨酸(methioninerestriction，MetR)飲食的研究中發(fā)現(xiàn)MetR飲食調(diào)節(jié)生物體線粒體的功能，減少活性氧的產(chǎn)生，降低對(duì)大分子物質(zhì)的

2、氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而減少內(nèi)源性損傷以及增強(qiáng)大分子物質(zhì)抗氧化能力。低蛋氨酸處理的LLC-PK細(xì)胞和MetR飲食處理的SD大鼠細(xì)胞旁路通透性降低，細(xì)胞以及大鼠腸上皮屏障功能增加，上皮緊密連接蛋白的表達(dá)改變。最近一項(xiàng)單中心臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MetR飲食有利于緩解CD患者的CDAI評(píng)分，由此我們推測(cè)：MetR飲食可能通過(guò)改變IBD腸上皮緊密連接的表達(dá)，降低腸黏膜通透性，從而修復(fù)腸黏膜屏障功能，促進(jìn)炎癥緩解。
　　 目的：研究MetR飲食對(duì)IB

3、D大鼠腸黏膜病理變化、腸上皮通透性以及腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)的影響，探討IBD患者應(yīng)用MetR飲食促進(jìn)和維持緩解的可能性。
　　 方法：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，全氨基酸飲食飼養(yǎng)(含蛋氨酸0.87％)，不限飲食，隨機(jī)分為DSS組(n=48)和對(duì)照組(n=42)，第7天按照DAI評(píng)分評(píng)估，以DAI>2.6，持續(xù)便血2天為條件篩選動(dòng)物到下一步實(shí)驗(yàn)。按照是否MetR飲食(含蛋氨酸0.17％)，將DSS組和對(duì)照

4、組分為：DSS+MetR，DSS+AA，MetR，AA組，每組15只。第21天腹主動(dòng)脈血分析血常規(guī)和肝腎功能、電解質(zhì)，取腸組織，HE染色分析腸黏膜病理變化，檢測(cè)腸組織MPO活性，PCNA免疫組化染色分析腸上皮細(xì)胞的增殖狀況，采用Ussingchamber檢測(cè)腸上皮細(xì)胞跨膜電阻抗，短路電流，跨膜電勢(shì)差；通過(guò)RT-PCR、免疫組化和WesternBlot從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平，以及蛋白的空間表達(dá)位置分析腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)。
　　

5、 結(jié)果：①經(jīng)DSS處理后大鼠全部出現(xiàn)腹瀉、便血、體重下降，HE染色第7天表現(xiàn)為腸上皮隱窩擴(kuò)張、潰瘍，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)尚未及肌層；第14天表現(xiàn)為透壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腸上皮糜爛、廣泛潰瘍；第21鏡下觀察可見(jiàn)隱窩擴(kuò)張、糜爛、糜爛上皮的周圍的可見(jiàn)多個(gè)淋巴濾泡增生。②MetR組大鼠同AA組比較，體重下降28％(n=15，P<0.01)，血BUN稍降低(n=9，P=0.041)。③MetR與從組腸上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有差異，根據(jù)Gaudio評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，DSS+

6、MetR組腸黏膜炎癥損傷顯著低于DSS+AA組(n=9，P=-0.01)④DSS+MetR和DSS+AA血WBC計(jì)數(shù)沒(méi)有顯著性差異(n=9，P=1)、腸組織MPO活性也沒(méi)有顯著性差異(n=9，P=0.982)。⑤Ussingchamber測(cè)試結(jié)果顯示DSS處理大鼠跨膜電阻抗、電勢(shì)差顯著低于正常對(duì)照大鼠，MetR組較從組腸上皮跨膜電阻抗增加(n=6，P=0.007)，短路電流和電勢(shì)差沒(méi)有差異；DSS+MetR組腸上皮跨膜電阻抗與電勢(shì)差與D

7、SS+AA沒(méi)有顯著差異(n=6，P=0.93)，但檢測(cè)到DSS+MetR組大鼠短路電流值較DSS+AA組顯著降低(n=6，P=0.036)。⑤組化PCNA染色結(jié)果提示DSS處理后結(jié)腸上皮細(xì)胞增生，MetR與從組大鼠PCNA陽(yáng)性率沒(méi)有差異，DSS+MetR組大鼠PCNA陽(yáng)性率稍高于DSS+AA組，沒(méi)有顯著差異(n=9，P=0.434)⑥D(zhuǎn)SS處理大鼠腸上皮緊密連接蛋白mRNA表達(dá)顯著下降，同AA組比較，MetR組腸上皮occludin、c

8、laudin3、claudin5mRNA表達(dá)水平增加；與DSS+AA組比較，DSS+MetR組occludinmRNA表達(dá)量增加1.69倍(n=9，P=0.055)，claudin3mRNA表達(dá)水平增加2.05倍(n=9，P=0.026)，claudin2RNA的表達(dá)水平降低的1.84倍(n=9，P=0.03)，claudin1、claudin4、claudin5、claudin7、zo-1mRNA差異不明顯。⑥免疫組織化學(xué)提示DSS處

9、理組claudin2，claudin3，occludin，ZO-1熒光連不連續(xù)，斷裂，隱窩擴(kuò)張，DSS+MetRclaudin3熒光強(qiáng)度顯著高于DSS+AA組，claudin2熒光強(qiáng)度較DSS+AA組弱，余未見(jiàn)明顯的差別。⑦Westernblot結(jié)果顯示MetR腸上皮claudin3蛋白表達(dá)量較AA大鼠增加2.02倍(n=9，P=0.02)，ZO-1、occlduin蛋白沒(méi)有差異。與DSS+AA組比較，DSS+MetR組claudin2

10、的表達(dá)量稍有降低(n=9，P=0.019)，claudin3蛋白的表達(dá)增加(n=9，P=0.003)，occludin蛋白表達(dá)DSS+從組大鼠稍增高，但是沒(méi)有顯著性差異(n=9，P=0.37)，
　　 結(jié)論：1.3％DSS經(jīng)飲水途徑誘導(dǎo)SD大鼠癥狀體征和病理表現(xiàn)和經(jīng)典IBD模型相同，本模型具有良好的可靠性和可重復(fù)性。2.IBD大鼠腸上皮緊密蛋白表達(dá)和空間結(jié)構(gòu)改變，腸上皮通透性增加，腸黏膜屏障功能受損。3.MetR飲食顯著降低正常

11、大鼠腸道通透性，增加封閉性claudin蛋白和咬合蛋白的表達(dá)，表明MetR飲食可通過(guò)影響緊密連接的表達(dá)和結(jié)構(gòu)而增強(qiáng)腸上皮屏障功能。4.與完全氨基酸飲食喂養(yǎng)組相比，MetR飲食減輕IBD大鼠腸黏膜炎癥損傷，然而血WBC、腸組織MPO酶水平和PCNA細(xì)胞無(wú)顯著差異，腸上皮通透性下降，緊密連接蛋白組成和空間結(jié)構(gòu)改變，表明MetR飲食不通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及促進(jìn)腸細(xì)胞生長(zhǎng)的途徑緩解炎癥損傷，而可能通過(guò)改變緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能而增加IBD大鼠