肝癌微環(huán)境中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞對肝癌轉(zhuǎn)移功能的影響及其機制研究.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤，死亡率居所有惡性腫瘤死亡率的第二位。腫瘤微環(huán)境(tumormicroenvironment，TME)是指腫瘤發(fā)生發(fā)展的局部病理環(huán)境。腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不僅由惡性腫瘤細胞自身決定，而且與腫瘤微環(huán)境中非腫瘤細胞成分密切相關(guān)，腫瘤微環(huán)境已經(jīng)成為癌癥基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophage，TAM)

2、是腫瘤微環(huán)境中眾多炎癥細胞的主要成員，約占炎癥細胞總數(shù)的30％-50％。本研究中，我們在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞的基礎(chǔ)上，采用BioLevitatorTM三維細胞培養(yǎng)儀，模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境在體外建立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞與肝癌細胞的立體共培養(yǎng)體系;運用iTRAQ與質(zhì)譜相結(jié)合的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞與肝癌細胞立體共培養(yǎng)體系外分泌蛋白質(zhì)的差異表達譜;基于生物信息學(xué)分析技術(shù)結(jié)合文獻報道篩選其中的關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)

3、分子，明確其對肝癌轉(zhuǎn)移功能的影響，并進一步采用RT-PCR和Westernblot等技術(shù)深入探討其促進肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制。本研究旨在從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度闡明M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞促進肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制，為今后肝癌轉(zhuǎn)移的靶向治療提供新思路。
　　第一部分 M1和M2兩種極化的巨噬細胞模型的體外誘導(dǎo)與鑒定
　　巨噬細胞由血液中的單核細胞分化而來，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體特異性免疫防御和非特異性免疫防御中均發(fā)揮重要作用。

4、巨噬細胞是一類動態(tài)變化的免疫細胞群，表型的異質(zhì)性和功能的多樣性是其主要的特征。巨噬細胞在不同的微環(huán)境能夠發(fā)生不同性質(zhì)的活化，分化成為具有不同表型標志物和功能特征的細胞亞群。研究表明，巨噬細胞的極化主要包括兩種類型:一種是經(jīng)典激活的巨噬細胞(classic activation ofmacrophage，M1)，另一種是替代激活的巨噬細胞(alternative activationof macrophage，M2)。本部分旨在體外建立M

5、1和M2兩種極化的巨噬細胞模型，為后繼的研究奠定基礎(chǔ)。我們在使用佛波酯(PMA)將人單核細胞白血病細胞THP-1體外誘導(dǎo)分化成為未分化的巨噬細胞(unactivatedmacrophage，UaM)的基礎(chǔ)上，選用脂多糖(LPS)和IFN-γ為M1型巨噬細胞的誘導(dǎo)劑，選用IL-4和IL-13為M2型巨噬細胞的誘導(dǎo)劑，使用倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的細胞形態(tài)變化，采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測M1和M2兩種巨噬細胞表面分子CD68、CD206和

6、CD163的表達水平，用ELISA檢測M1和M2兩種巨噬細胞培養(yǎng)上清液中IL-10和IL-12的分泌水平，用熒光定量PCR檢測M1和M2兩種巨噬細胞不同表型分子標志物TNF-α、CCL3、iNOS、Arg-1、AMAC-1和CCL22 mRNA的相對表達水平。結(jié)果顯示，M1型巨噬細胞呈不規(guī)則形或者長梭形，高表達IL-12、TNF-α、CCL3和iNOS; M2型巨噬細胞多呈圓形或類圓形，抱團生長，高表達IL-10、CD206、CD163

7、、Arg-1、AMAC-1和CCL22，研究結(jié)果與文獻報道相符，表明我們成功建立了M1和M2兩種極化的巨噬細胞模型。
　　第二部分 M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞在肝癌細胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymaltransition，EMT)是上皮源性腫瘤轉(zhuǎn)移的首要步驟，已成為腫瘤轉(zhuǎn)移研究的焦點。肝癌是一種典型的上皮源性腫瘤，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和缺乏有效的治療手段是導(dǎo)致其高死亡率的主要原

8、因，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已經(jīng)成為提高肝癌治療效果與生存率的最大障礙。腫瘤的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不僅由惡性腫瘤細胞自身決定，而且與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞主要是M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞。本部分主要研究M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞對肝癌細胞侵襲、遷移和粘附能力以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，探討M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用。我們在體外將人單核白血病細胞THP-1誘導(dǎo)分化成為M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞的基礎(chǔ)上，采用transwell小室建

9、立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞與肝癌細胞Huh7和SMMC7721的共培養(yǎng)體系，利用侵襲實驗、遷移實驗和粘附實驗檢測共培養(yǎng)后Huh7和SMMC7721細胞侵襲、遷移和粘附能力的變化，用熒光定量PCR檢測共培養(yǎng)前后Huh7和SMMC7721細胞EMT相關(guān)標志物E-cadherin, N-cadherin, Vimentin和α-smooth muscle actin(α-SMA)mRNA的相對表達水平。結(jié)果顯示，與M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞共培養(yǎng)4

10、8 h后，肝癌細胞Huh7和SMMC7721形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，由原來上皮細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成為一種梭形的間質(zhì)細胞形態(tài)，細胞的侵襲和遷移能力增強，而粘附能力下降。熒光定量PCR顯示，共培養(yǎng)后Huh7和SMMC7721細胞上皮標志物E-cadherinmRNA相對表達水平下降，間質(zhì)標志物N-cadherin，Vimentin和α-SMA mRNA相對表達水平上升，表明M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞通過誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生EMT促進肝癌細胞侵襲。
　

11、　第三部分 M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞與肝癌細胞的三維立體共培養(yǎng)體系的建立及關(guān)鍵差異蛋白的篩選與驗證
　　分泌蛋白質(zhì)組(secretome)是指在一定的時間和空間條件下，組織和細胞等分泌的全部蛋白質(zhì)。分泌蛋白質(zhì)組學(xué)(Secretomics)是指利用蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)技術(shù)對分泌蛋白質(zhì)進行廣泛和深入的研究。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞與間質(zhì)細胞相互作用，相互影響，共同決定了腫瘤細胞的歸宿。在腫瘤細胞與間質(zhì)細胞相互作用的過程中，腫

12、瘤微環(huán)境中的分泌蛋白質(zhì)充當了“橋梁”的作用，其功能網(wǎng)絡(luò)是維持腫瘤與間質(zhì)穩(wěn)態(tài)，決定腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要媒介。本部分中，我們應(yīng)用BioLevitatorTM三維細胞培養(yǎng)儀，模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境在體外建立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞與肝癌細胞的立體共培養(yǎng)體系;運用iTRAQ與質(zhì)譜相結(jié)合的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞與肝癌細胞立體共培養(yǎng)體系外分泌蛋白質(zhì)的差異表達譜;采用生物信息學(xué)分析技術(shù)結(jié)合文獻報道篩選其中的關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)分子，并使用W

13、estern blot對部分關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)分子進行表達驗證，為進一步深入探討腫瘤微環(huán)境中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞與肝癌細胞的相互作用，闡明M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞促進肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制提供實驗依據(jù)。
　　第四部分 巨噬細胞源性IL-1β對肝癌細胞轉(zhuǎn)移功能的影響及其分子機制研究
　　肝癌是一種經(jīng)典的炎癥伴隨腫瘤，病因以慢性肝炎病毒感染為主，具有慢性炎癥改變和免疫調(diào)節(jié)紊亂兩大病變基礎(chǔ)。隨著慢性炎癥在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用得到進一步解析

14、，炎癥與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。白細胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)是體內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的核心介質(zhì)，主要由炎癥狀態(tài)下或免疫反應(yīng)中巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生，其對肝癌轉(zhuǎn)移功能的影響及相關(guān)機制尚不明確。本部分中，我們使用外源性重組人IL-1β誘導(dǎo)培養(yǎng)肝癌細胞SMMC7721，采用侵襲實驗、遷移實驗和粘附實驗檢測IL-1β對肝癌細胞SMMC7721侵襲能力、遷移能力和粘附能力的影響，用熒光定量PCR檢測EMT相關(guān)標

15、志物mRNA的相對表達水平，用Western blot檢測IL-1β誘導(dǎo)不同時間點SMMC7721細胞NF-κ B通路信號分子NF-κB（p65，胞核）、IκBα（胞漿）和P-IκBα（胞漿）以及EMT相關(guān)標志物Snail的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)48 h后，SMMC7721細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細胞向成纖維細胞樣梭形改變;細胞的侵襲和遷移能力增強，粘附能力下降;細胞上皮標志物E-cadherin mRNA表達水平下降

16、，間質(zhì)標志物N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2mRNA表達水平上升;Western blot結(jié)果顯示IL-1β誘導(dǎo)后NF-κB(p65，胞核)、P-IκBα（胞漿）和Snail蛋白表達上調(diào)，IκBα（胞漿）蛋白表達下調(diào)，并且具有明顯的時間依賴性。另外，NF-κB通路特異性抑制劑BAY11-7082處理能夠減弱甚至逆轉(zhuǎn)IL-1β對肝癌細胞SMMC7721轉(zhuǎn)移潛能及EMT的促進作用。研究結(jié)果表明

17、，IL-1β通過NF-κB/Snail途徑誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生EMT，進而促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能，阻斷NF-κ B通路能夠顯著降低IL-1β對肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的促進作用，IL-1β可能是肝癌轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。
　　1.體外成功誘導(dǎo)并建立了M1和M2兩種極化的巨噬細胞模型。
　　2.M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞主要通過誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生EMT增強肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能。
　　3.成功應(yīng)用BioLevitatorTM三維細胞培養(yǎng)儀

18、模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境在體外建立了M2、SMMC7721以及M2+SMMC7721的三種立體培養(yǎng)體系，并運用iTRAQ與質(zhì)譜相結(jié)合的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立了三種立體培養(yǎng)體系外分泌蛋白質(zhì)的差異表達譜，其中IL-1β是M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞與SMMC7721細胞共培養(yǎng)相互誘導(dǎo)產(chǎn)生的關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)分子，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　4.IL-1β主要通過參與調(diào)節(jié)NF-κB/Snail信號通路影響肝癌細胞的EMT進程，最終發(fā)揮其促進肝癌細胞轉(zhuǎn)移