轉移相關蛋白GOLPH2在肝細胞肝癌中的表達及功能研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)(簡稱肝癌)是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤死因第三位、我國惡性腫瘤死因第二位(世界半數以上病例發(fā)生在我國)。雖然部分肝癌病人經過早期、積極、綜合治療獲得長期生存，但腫瘤轉移復發(fā)已成為進一步提高肝癌治療效果的最主要障礙。研究表明肝癌根治性切除后5年復發(fā)轉移率高達60％。目前臨床的主要困擾在于無法早期預測哪些病人會發(fā)生轉移復發(fā)，更無有效防治措施，其

2、關鍵在于轉移機理不清。如能探明肝癌轉移的分子機理及其關鍵調控環(huán)節(jié)，將有助于早期識別或預測哪些病人易于轉移，有助于探索有效的干預措施和治療手段，以進一步提高肝癌治療效果、延長病人生存。
　　我所前期工作中，通過比較40例伴與不伴肝內轉移肝癌間、肝癌肝內轉移灶與原發(fā)瘤間基因表達譜的差異，結果發(fā)現肝癌原發(fā)瘤與其肝內轉移灶基因表達譜非常相似，而伴與不伴轉移肝癌原發(fā)瘤基因表達譜差異非常明顯，在9180個基因中153個基因表達差異有顯著性(p

3、<0.001)，據此課題組在國際上首次提出促使肝癌轉移的基因改變發(fā)生在原發(fā)腫瘤階段的新觀點(YeQH，etal.NatMed2003)，為肝癌轉移早期預測和及時防治提供了可能的理論基礎。在此基礎上，進一步采用激光捕獲顯微切割(LCM)、基因表達譜芯片和SNP芯片等技術研究肝癌肝外轉移灶與原發(fā)瘤之間以及有和無肝外轉移肝癌原發(fā)瘤之間基因變化的差異，對前期工作中提出的促使肝癌轉移基因改變發(fā)生在原發(fā)瘤階段的新觀點進行了深入驗證。同時還篩選出一些

4、可能在肝癌肝外轉移進程中起重要作用的候選基因，可能為肝癌轉移早期預測和及時干預提供重要靶標。其中高爾基體膜相關蛋白(typeⅡGolgimembraneprotein，GOLPH2，又稱GP73)是表達差異最顯著的一個分子。
　　文獻報道稱GOLPH2在肝癌患者血清中表達水平升高，可能成為HCC的一個血清學指標，但其在HCC發(fā)生、侵襲、轉移中的作用尚未見報道。本課題擬在前期工作基礎上，進一步驗證GOLPH2基因(GOLM1)在不同

5、肝臟及肝腫瘤組織中的表達情況，并用免疫組織化學方法分析其在肝癌組織中的表達及其與臨床病理因素及預后的關系；同時用慢病毒介導的RNA干擾技術構建穩(wěn)定的GOLPH2沉默表達肝癌細胞株，觀察肝癌細胞生長和侵襲等生物學行為的改變，并探討其相關機制。
　　方法
　　用RT-PCR方法驗證基因GOLM1在137例不同正常肝組織、癌胖組織及肝癌(20例伴肝外轉移HCC組織、41例肝內轉移HCC組織、29例無轉移HCC組織、36例HCE癌旁

6、組織、11例正常肝組織)組織中的表達情況，同時運用免疫組織化學方法檢測GOLPH2在一套獨立的組織芯片(包括102例HCC肝癌組織、17例正常肝組織)中的表達情況，分析GOLPH2蛋白表達與臨床病理特征及預后的關系。應用慢病毒介導的RNA抑制GOLM1表達，獲得穩(wěn)定的GOLM1低表達的MHCC97H細胞株，應用RT-PCR及western-blot方法驗證干擾效果；并進一步觀察穩(wěn)定干擾后細胞株的生物學行為的改變(增殖及克隆能力等)。

7、r>　　結果
　　RT-PCR結果顯示，與癌旁組織和正常肝組織相比，肝癌組織中GOLM1mRNA表達明顯上調(P<0.0001)，而伴轉移肝癌組織中GOLM1表達較無轉移肝癌顯著增高(P<0.05)。免疫組化檢測結果顯示，GOL2H2主要表達于腫瘤組織中，在癌旁有部分人群呈中低度表達，而在正常肝組織中幾乎無表達。GOLPH2低表達患者的至復發(fā)時間(TTR)及總體生存(OS)顯著好于GOLPH2高表達患者(TTR：P=0.019；O

8、S：P=0.007)。多因素分析結果也提示GOLPH2是一個影響肝癌預后的獨立因素(P=0.023)，可以用于預測肝癌患者的復發(fā)及總體生存。通過慢病毒介導的體系，我們篩選得到穩(wěn)定感染細胞株MHCC97H-Lenti.GOLM1i-1、MHCC97H-Lenti.GOLM1i-3、MHCC97H-Lenti.GOLM1i-2、MHCC97H-Lenti.GOLM1i-4、MHCC97H-Lenti.GOLM1i-5M。Real-TimeP

9、CR結果顯示各組GOLM1抑制率分別為Lenti.GOLM1i-1(G1)81.05％、Lenti.GOLM1i-2(G2)36.22％、Lenti.GOLM1i-3(G3)84.61％、Lenti.GOLM1i-4(G4)9.25％、Lenti.GOLM1i-5M(SCR)10.75％，Westernblot檢測進一步證實上述結果，各組細胞GOLPH2蛋白的表達有顯著差異。穩(wěn)定干擾后的97H肝癌細胞珠體外增殖能力及克隆形成能力均受明顯