Peroxiredoxin2在肝細胞肝癌膽汁中高表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  本實驗運用蛋白組學技術(shù),對肝細胞肝癌(HCC)和膽結(jié)石病膽汁進行對照性研究,篩選用于診斷HCC的腫瘤標記物。
  方法:
  收集HCC和膽結(jié)石病膽汁及血清樣本。去除膽汁中的細胞碎片、膽固醇、黏液;使用cleanasciteTM試劑盒除去其中的磷脂;采用3kDa超濾管濃縮膽汁并濾去多余的鹽份。Bradford法檢測實驗樣本蛋白濃度。運用雙向電泳技術(shù)分離HCC和膽結(jié)石病膽汁混合蛋白,其中IPG膠條為pH4-7

2、,17cm,NL。根據(jù)凝膠不同染色方法,而決定蛋白上樣量,其中考馬斯亮藍(R-350)溶液染色,蛋白上樣量為1mg;硝酸銀染色,蛋白上樣量為150μg。考馬斯亮藍(R-350)溶液染色后的凝膠使用10%乙酸溶液脫色。凝膠蛋白點清晰可見,運用GS-800校準型光密度儀透射掃描凝膠。使用PDQuest8.02D凝膠圖像專業(yè)分析軟件對掃描圖像進行分析,尋找 HCC和膽結(jié)石病膽汁凝膠的差異表達蛋白點。切取差異表達超過2倍的凝膠蛋白點,對其進行酶

3、解、純化,利用MALDI-TOF儀器進行蛋白質(zhì)譜鑒定,獲取蛋白指紋圖譜(PMF),使用Mascot和MS-fit軟件對國際數(shù)據(jù)庫生物信息學檢索及分析,鑒定出差異表達蛋白,并查詢其生物學功能,了解與HCC的相關性。使用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測方法驗證硫氧還原蛋白過氧化物酶2(Peroxiredoxin2,PRDX2)在HCC和膽結(jié)石病的膽汁及血清中的表達情況。
  結(jié)果:
  

4、成功建立HCC和膽結(jié)石病膽汁的雙向電泳凝膠圖,其重復性好,分辨率高。兩種不同染色方法染色的凝膠,背景干凈,蛋白點清晰可見,無明顯的橫向及縱向拖尾。PDQuest軟件分析考馬斯亮藍溶液染色的凝膠掃描圖像顯示HCC與膽結(jié)石病膽汁存在126個差異表達蛋白點,對其中32個差異表達超過2倍的蛋白點進行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)14種差異表達蛋白。通過對蛋白功能查詢后,發(fā)現(xiàn)PRDX2蛋白表達量與HCC發(fā)病存在一定的相關性。Western blot和ELIS

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