肝癌轉(zhuǎn)移亞細(xì)胞系的建立及分離肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的研究.pdf

1、該研究采用人肝癌細(xì)胞H7402,腋后背部皮下接種SCID鼠,接種后7天時(shí)成瘤,接種后66天時(shí),在荷瘤鼠贏弱時(shí)引頸處死,取其肺組織,進(jìn)行原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng),傳代10代以后,細(xì)胞形態(tài)不變,且可以連續(xù)傳代,將該細(xì)胞系命名為M-H7402.然后,對(duì)M-H7402細(xì)胞進(jìn)行了生物學(xué)鑒定,檢測(cè)了細(xì)胞形態(tài)、染色體、細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞周期、甲胎蛋白表達(dá)、癌基因表達(dá)、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞回接SCID鼠成瘤實(shí)驗(yàn)等指標(biāo).結(jié)果顯示M-H7402細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和

2、形態(tài)等與親本細(xì)胞H7402十分相近,其染色體形態(tài)仍為人類(lèi)核型,眾數(shù)維持在72~80之間,占75.0﹪.RT-PCR檢測(cè)M-H7402細(xì)胞甲胎蛋白的表達(dá),結(jié)果為陽(yáng)性.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與H-7402細(xì)胞相比,M-H7402細(xì)胞癌基因c-myc表達(dá)水平較高,轉(zhuǎn)移抑制基因nm23的表達(dá)水平明顯下調(diào),確定M-H7402細(xì)胞為親本細(xì)胞H7402的亞克隆細(xì)胞.應(yīng)用SCID鼠篩選獲得的肝癌轉(zhuǎn)移亞細(xì)胞系M-H7402,與親本細(xì)胞系H

3、7402形成了配對(duì)關(guān)系.在上述研究基礎(chǔ)上,該研究采用配對(duì)細(xì)胞H7402和M-H7402,運(yùn)用mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR),篩選差異表達(dá)的基因.結(jié)果篩選出9條較明顯的差異表達(dá)片段,將其中一條在M-H7402細(xì)胞中表達(dá)較高的差異片段M10和一條在H7402細(xì)胞中表達(dá)較高的差異片段M2進(jìn)行克隆和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank進(jìn)行同源比較,顯示M10片段為PolyA結(jié)合蛋白,M2片段為Rab5a.然后,又經(jīng)RT-PCR和Wester

4、n Blot進(jìn)一步證實(shí),顯示與DDRT-PCR結(jié)果相符.有文獻(xiàn)報(bào)道,PolyA結(jié)合蛋白能夠影響mRNA的穩(wěn)定性,在調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有重要的作用.Rab5a為ras GTP結(jié)合蛋白,與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白分選相關(guān),而且與信號(hào)傳導(dǎo)、受體下調(diào)和病原體吞噬有關(guān).該研究發(fā)現(xiàn)在M-H7402細(xì)胞中PolyA結(jié)合蛋白表達(dá)上調(diào),Rab5a表達(dá)下調(diào),提示PolyA結(jié)合蛋白和Rab5a可能與肝癌轉(zhuǎn)移有關(guān).該研究進(jìn)一步運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從蛋白水平上分離肝癌

5、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白.運(yùn)用二維電泳技術(shù),比較了M-H7402細(xì)胞和親本H7402細(xì)胞的全蛋白,發(fā)現(xiàn)3個(gè)在M-H7402細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),分別標(biāo)記為MP1、MP2和MP3,差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)ESI-QUAD-TOF質(zhì)譜分析后,通過(guò)與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比較,初步確定MP1為原肌球蛋白(Tropomyosin),MP2為波形纖維蛋白(Vimentin),MP3為熱休克蛋白70(Heat shock 70KDa protein,HSP70).原肌球蛋白是肌