肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志蛋白的研究.pdf

1、[目的]
　　原發(fā)性肝癌是惡性程度高、死亡率高的消化系統(tǒng)腫瘤。肝細(xì)胞性肝癌占原發(fā)性肝惡性腫瘤90％,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響其生存率的主要因素。目前,除AFP外仍沒(méi)有一種得到公認(rèn)可作為臨床常規(guī)檢查的有效的腫瘤標(biāo)志物。因而,尋找肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)標(biāo)志蛋白,探討其分子機(jī)制已經(jīng)成為肝癌相關(guān)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。外周血血漿包含豐富的蛋白質(zhì),肝臟局部的組織病理改變也可以表現(xiàn)在血漿蛋白質(zhì)成分和數(shù)量的改變,此類(lèi)特征性變化有可能作為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)指標(biāo),對(duì)于腫瘤診

2、治有重要意義。本研究采用一個(gè)新的研究方法鑒定腫瘤組織釋放到血液中的游離蛋白,以此尋找肝癌的候選腫瘤標(biāo)志物,并且進(jìn)行了臨床標(biāo)本驗(yàn)證。
　　 [方法]
　　 采用本實(shí)驗(yàn)室前期工作構(gòu)建的體液中腫瘤相關(guān)蛋白研究體系,收集了12例肝細(xì)胞性肝癌患者的腫瘤組織和癌旁肝組織樣品,采用上皮細(xì)胞專(zhuān)用無(wú)血清培養(yǎng)基建立了體外原代培養(yǎng)并收集其條件培養(yǎng)基；其中6例(對(duì))條件培養(yǎng)基所含總蛋白經(jīng)過(guò)透析濃縮除鹽后,以10％聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PA

3、GE)分離,隨后進(jìn)行質(zhì)譜分析,以此構(gòu)建肝細(xì)胞性肝癌相關(guān)游離蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白利用DAVID Bioinformatics Resources(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)合目前己發(fā)表的肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)基因表達(dá)譜及蛋白標(biāo)志數(shù)據(jù)庫(kù)信息,選定候選肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移蛋白標(biāo)志。將首選候選肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移蛋白標(biāo)志MMP1和MMP7進(jìn)行回顧性驗(yàn)證?；仡櫺詮?fù)習(xí)肝癌病例69例,將其

4、中治療后2年后無(wú)瘤生存者定義為“極好組”,治療后1年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移/2年內(nèi)死亡者定義為“極差組”；針對(duì)極好組(34例)與極差組(35例)患者的腫瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。同時(shí),通過(guò)ELISA的方法,分析候選蛋白MMP1、MMP7以及NID1在126例肝細(xì)胞肝癌病例和104例正常人群血漿中的蛋白水平差異。
　　 [結(jié)果]
　　 本研究從肝癌和癌旁組織原代培養(yǎng)的6對(duì)條件培養(yǎng)基樣品中共鑒定出1365個(gè)高可信度蛋白,初步建立了肝細(xì)胞肝

5、癌相關(guān)游離蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。其中細(xì)胞外(分泌)蛋白占16％,膜蛋白占3％,胞漿蛋白占21％。免疫組化分析結(jié)果顯示,MMP1在癌旁肝組織的陽(yáng)性表達(dá)與預(yù)后分組、肝被膜浸潤(rùn)存在顯著性相關(guān)；而MMP7蛋白在癌旁肝組織的表達(dá)水平顯著性高于癌組織。ELISA結(jié)果顯示,MMP1、MMP7和NID1肝癌病人血漿的蛋白水平顯著高于正常人群對(duì)照組。NID1與肝被膜浸潤(rùn)、肝炎肝病背景存在顯著性負(fù)相關(guān)。MMP7與腫瘤衛(wèi)星灶、腫瘤個(gè)數(shù)、肝炎肝病背景存在顯著性正相關(guān)。M