三羥基異黃酮防治肝癌術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是我國和某些亞非地區(qū)常見癌癥。全球肝癌的發(fā)病率在各種癌癥中排列第五。手術(shù)切除仍被公認為是治療肝癌的最有效手段，但肝癌根治性切除術(shù)后的復發(fā)率高達60-80％，肝癌切除術(shù)后較高的復發(fā)率成為影響肝癌預后的主要障礙。目前尚缺少一種有效的方法預防肝癌術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移。肝細胞癌對大多數(shù)抗癌藥物敏感性差，傳統(tǒng)的藥物有5-氟脲嘧啶(5-Fu)、順鉑、阿霉素(ADM)、環(huán)磷酰胺(MMC)等，療效多在10％-20％之間。因此尋找一種高

2、效、低毒性的藥物或一種能與化療藥物聯(lián)用，而減少化療藥物用量，增加療效的藥物是十分有意義的。三羥基異黃酮(Genistein)是大豆在生長過程中形成的次級代謝產(chǎn)物，近年來研究顯示其具有顯著的防治腫瘤效果。本篇論文報告：通過體外實驗研究Genistein對高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株HCCLM3增殖及與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的粘附、運動、侵襲能力的影響及相關(guān)分子機制；建立模擬人肝癌切除術(shù)后高轉(zhuǎn)移復發(fā)的裸鼠模型，研究Genistein對肝癌切除術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)的影

3、響及分子機制；通過體內(nèi)體外實驗研究Genistein與順鉑聯(lián)用是否具有抗腫瘤增殖、復發(fā)轉(zhuǎn)移的協(xié)同作用及二者協(xié)同的相關(guān)分子機制。 第一部分三羥基異黃酮對HCCLM3肝癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機制 目的：探討Genstein對肝癌高轉(zhuǎn)移細胞株HCCLM3增殖、凋亡及與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的粘附、侵襲、運動能力的影響及機制。 方法：人高轉(zhuǎn)移肝細胞癌細胞系HCCLM3作為研究對象，用倒置顯微鏡觀察Getlistein對肝

4、癌細胞形態(tài)的影響；MTT法檢測不同濃度Genistein對肝癌細胞生長的影響；流式細胞術(shù)檢測Genistein處理后細胞凋亡率和細胞周期變化；侵襲、運動及粘附實驗觀察藥物作用后與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的細胞粘附、運動及侵襲能力的變化；采用細胞爬片免疫細胞化學法檢測Gerlistein對與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)及上皮細胞鈣粘蛋白(E-Cadherin

5、)表達的影響。 結(jié)果： (1)Genistein處理組較對照組細胞存活率降低，并且這種作用隨時間和藥物濃度增加更加明顯； (2)對照組細胞凋亡率為10.30％，G<,0>/G<,1>期細胞分布為33.78％，Genistein組細胞凋亡率為13.90％，G<,0>/G<,1>期細胞分布為41.85％，差別均有統(tǒng)計學意義； (3)Genistein組細胞對Matrigel膠和FN的粘附抑制率40umol/L

6、濃度為55.65％和45.33％，80umol/L濃度為75.16％和66.67％，在Transwell小室中的細胞相對侵襲率Genistein 40umol/L和80umol/L處理后分別為69.73％和53.59％，運動細胞相對數(shù)Genistein 40umol/L和80umol/L處理后分別為79.70％和70.17％，與對照相比差別均有統(tǒng)計學意義； (4)Genistein處理組MMP-2、VEGF細胞爬片免疫細胞化學染

7、色HSCORE得分為2.13±0.11和2.45±0.16，對照組為2.44±0.23和3.08±0.16，兩組間有統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：Genistein對HCCLM3細胞生長具有抑制作用，且具時間及濃度依賴性；Genistein使HCCLM3細胞阻滯于G<,0>/G<,1>期，凋亡率增加：Genistein能抑制HCCLM3細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的粘附、運動和侵襲能力；其機制可能與Genistein能降低MMP-2的表達，抑制腫瘤

8、侵襲有關(guān)，另外Genistein還能通過降低MMP-2和VEGF的表達，可能具有減少腫瘤血管生成的作用。 第二部分三羥基異黃酮對裸鼠肝癌切除術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)的影響及機制 目的：探討Genistein對裸鼠肝癌切除術(shù)后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的影響及其機制。 方法：建立模擬人肝癌切除術(shù)后腫瘤高轉(zhuǎn)移復發(fā)的裸鼠模型，實驗組給予2mg/kg Genistein溶液腹腔注射，隔日一次，共4周，觀察裸鼠一般情況及腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移情況。肝臟復

9、發(fā)腫瘤免疫組化檢測MMP-2、TlMP-2、E-Cadherin和VEGF的表達。 結(jié)果： (1)對照組裸鼠肝臟復發(fā)灶體積1917.00±647.55 mm<'3>，肝內(nèi)散播灶數(shù)量1.67±1.21個/只，肺轉(zhuǎn)移為5.50±1.05個/只，轉(zhuǎn)移累及其他臟器部位數(shù)為2.17±1.17個/只，Genistein處理組肝臟復發(fā)灶體積1011.88±401.14 mm<'3>，肝內(nèi)散播灶數(shù)量0.50±0.76個/只，肺轉(zhuǎn)移為3.75±1

10、.58個/只，轉(zhuǎn)移累及其他臟器部位數(shù)為1.00±0.76個/只，兩組差別均有統(tǒng)計學意義；(2)對照組肝臟復發(fā)腫瘤MMP-2和VEGF免疫組化染色HSCORE積分為2.75±0.04和2.58±0.05，Getlstein組為2.56±0.19和2.43±0.04，兩組有統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：Genistein對裸鼠肝癌切除術(shù)后復發(fā)灶的生長和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有抑制作用，對肝癌切除術(shù)后肺及其他臟器轉(zhuǎn)移有抑制作用；Genistein抑制肝癌切除

11、術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移機制可能與其抑制復發(fā)腫瘤MMP-2和VEGF的表達有關(guān)系。 第三部分三羥基異黃酮聯(lián)合順鉑對肝癌切除術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的影響及機制 目的：探討Genistein與順鉑聯(lián)用對肝癌切除術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的協(xié)同抑制作用及其機制。 方法：MTT法檢測不同濃度Genistein與順鉑聯(lián)用對肝癌細胞HCCLM3增殖的影響，利用中效原理及公式計算中效劑量和合用指數(shù)；流式細胞術(shù)檢測Genistein與順鉑聯(lián)用對細胞凋亡率和細胞周期

12、變化的影響；侵襲、運動及粘附實驗觀察Genistein與順鉑聯(lián)用對細胞粘附、運動及侵襲能力的影響；細胞爬片免疫細胞化學法檢測Genistein與順鉑聯(lián)用對HCCLM3細胞VEGF、MMP-2及細胞核因子-kB(NF-k3)表達的影響；建立模擬人肝癌切除術(shù)后腫瘤高轉(zhuǎn)移復發(fā)的裸鼠模型，觀察Genistein與順鉑聯(lián)用對裸鼠肝癌切除術(shù)后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的影響，金正均公式評價二者對肝臟復發(fā)灶和肺部轉(zhuǎn)移是否有協(xié)同抑制作用；免疫組化檢測Genistei

13、n與順鉑聯(lián)用對肝臟復發(fā)腫瘤NF-kB、MMP-2及VEGF表達的影響；實時熒光定量PCR檢測Genistein與順鉑聯(lián)用對肝臟復發(fā)腫瘤MMP-2 mRNA表達的影響。 結(jié)果： (1)Genistein與順鉑聯(lián)用較單用組HCCLM3細胞存活率降低，Genistein與順鉑單用時的中效劑量為152.44umol/L和52.75umol/L，而兩藥合用時達到中效的二者濃度為59.30umol/L和14.83umol/L，Gen

14、istein、順鉑聯(lián)用在低濃度起拮抗作用，當抑制率大于41.1％，即Getlistein大于41.51umol/L順鉑大于10.38umol/L時，二者合用可產(chǎn)生協(xié)同作用； (2)Genistein與順鉑聯(lián)用組HCCLM3細胞凋亡率為67.30％，G<,0>/G<,1>期分布細胞為93.88％，Genistein單用組細胞凋亡率13.90％，G<,0>/G<,1>期分布細胞41.85％，順鉑組細胞凋亡率為48.54％，G<,0>

15、/G<,1>期分布細胞63.95％，聯(lián)用與單用有統(tǒng)計學差異。 (3)Genistein與順鉑聯(lián)用對Matrigel膠和FN細胞粘附抑制率與Genistein單用組相比無統(tǒng)計學差異，相對侵襲率和運動細胞相對數(shù)也無統(tǒng)計學差異； (4)HCCLM3細胞順鉑處理組MMP-2、NF-kB HSCORE得分為2.78±0.19和2.95±0.08，聯(lián)用組為2.12±0.31和2.46±0.07，對照組為2.44±0.23和2.79±

16、0.06，三組間均有統(tǒng)計學差別； (5)與單用Genistein及順鉑比較，二者聯(lián)用裸鼠肝臟復發(fā)灶體積減小，肺轉(zhuǎn)移數(shù)減少，用金正均公式來計算Genistein與順鉑聯(lián)用對裸鼠術(shù)后肝癌復發(fā)灶體積和肺轉(zhuǎn)移抑制的q值分別為1.09和1.55； (6)順鉑處理組裸鼠復發(fā)腫瘤NF-kB、MMP-2免疫組化染色HSCORE得分為2.98±0.04和3.00±0.04，聯(lián)用組為2.38±0.03和2.47±0.10，對照組為2.51±

17、0.04和2.75±0.04，三組間均有統(tǒng)計學差別： (7)實時熒光定量PCR檢測順鉑組MMP-2 mRNA表達是對照組的2.06倍，Genistein與順鉑聯(lián)用組是對照組的0.44倍。 結(jié)論：本部分實驗結(jié)果表明在體外Genistein與順鉑聯(lián)用隨著濃度增加二者對HCCLM3細胞增殖具有協(xié)同抑制作用；Genistein與順鉑聯(lián)用較單用誘導HCCLM3細胞凋亡作用更明顯，主要引起細胞G<,0>/G<,1>期阻滯；Genis

18、tein與順鉑聯(lián)用對HCCLM3細胞體外粘附、侵襲及運動能力抑制較單用Genistein無明顯增強；Genistein與順鉑聯(lián)用在體內(nèi)對裸鼠肝癌切除術(shù)后的腫瘤復發(fā)灶具有相加抑制作用，對裸鼠肝癌切除術(shù)后肺轉(zhuǎn)移具有協(xié)同抑制作用；Genistein與順鉑聯(lián)用對肝癌切除術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移抑制的協(xié)同機制可能在于Genistein能降低順鉑誘導的NF-kB升高，增加腫瘤細胞凋亡，抑制增殖，同時Genistein也能抑制可能是NF-kB升高后造成的MMP-