肝癌HepG2細胞IER5基因高表達細胞系的建立及其輻射效應研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是我國常見惡性腫瘤,新發(fā)肝癌病例中55％在我國,診治形式十分嚴峻,臨床研究證實三維適形放療是肝癌治療的有力武器。輻射敏感性是影響腫瘤放療效果的重要因素,輻射敏感與輻射敏感基因有關。如果某基因在輻射后出現(xiàn)表達變化,這種表達變化能夠促進腫瘤細胞凋亡或抑制腫瘤細胞生長,那么該基因就可能為腫瘤的輻射敏感基因。本課題組的前期研究顯示:輻射可引起早期反應基因IER5 mRNA表達上調(diào),人肝癌細胞IER-5基因?qū)椛洚惓Ｃ舾?在

2、4Gy輻射后其mRNA水平為未輻射細胞的11.54倍。國外文獻揭示IER5基因與細胞分裂、細胞凋亡有關。這就提示我們IER5基因可能與肝癌的輻射敏感性有關。
　　 本研究旨在探索IER5基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學功能及其輻射敏感性。為了深入研究肝癌細胞IER5基因的輻射生物學功能,就有必要探索IER5基因高表達及基因沉默對細胞輻射效應的影響。穩(wěn)定高表達(定義)是指將外源基因?qū)氚屑毎募夹g(shù),常用的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是將純化的含有靶基

3、因的質(zhì)粒DNA送入細胞內(nèi),并在細胞內(nèi)表達。建立穩(wěn)定的細胞系,根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,對靶細胞進行篩選,最常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin),篩選后得到穩(wěn)定表達外源基因的單克隆細胞。本實驗以人肝癌HepG2細胞為研究對象,構(gòu)建IER5基因高表達細胞系,研究IER5基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學功能及輻射效應。同期實驗組其他成員采用RNA干擾技術(shù),轉(zhuǎn)染HepG2

4、細胞,建立IER5基因表達抑制細胞模型,研究基因表達抑制后對應參數(shù)的變化。兩者對比結(jié)合,從基因水平探索IER5基因與肝癌輻射有關的生物學功能,探求IER5基因是否為肝癌的輻射敏感基因,能否成為肝癌放療中一個潛在增敏靶點,為今后分子靶向治療藥物的研發(fā)提供理論指導。
　　 目的:本課題選擇離體肝癌HepG2細胞作為研究對象,采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選單克隆技術(shù),轉(zhuǎn)染HepG2,建立IER5基因過表達細胞模型,探討IER5基因過表達對HepG2

5、細胞增殖、細胞周期、輻射效應及細胞凋亡的影響,進一步探討該基因的生物學功能,探求該基因是否為肝癌的輻射敏感基因。
　　 方法:1 IER5基因高表達細胞系(IER5-overexpression-HepG2)的建立:設計特異性表達IER5基因的質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染的技術(shù),轉(zhuǎn)染HepG2細胞,建立IER5基因高表達細胞模型,通過G418篩選與單克隆細胞的培養(yǎng),形成了具有IER5基因高表達的單克隆HepG2細胞系,即IER5

6、-overexpression-HepG2細胞系。同時設陰性對照(HepG2-Control),即將與人類編碼基因序列無同源性的片段與載體連接轉(zhuǎn)染細胞。采用Western Blotting技術(shù)檢測HepG2細胞IER5蛋白質(zhì)的表達,篩選有效的IER5基因過表達的單克隆細胞系(據(jù)挑選單克隆細胞時的備份號將細胞編號為HepG2-10、HepG2-11、HepG2-15、HepG2-20、HepG2-24、HepG2-21)。
　　

7、2研究IER5基因高表達對HepG2細胞增殖、細胞周期和輻射效應的影響:檢測0Gy、2Gy、4Gy輻射情況下腫瘤細胞生長曲線,以及0Gy、2Gy、4Gy輻射情況下細胞的周期及細胞凋亡(采用流式細胞術(shù))。
　　 結(jié)果:1 IER5基因高表達細胞模型(IER5-over-expression-HepG2)的建立:經(jīng)Western Blotting技術(shù)檢測顯示:相對于HepG2-Control及其他細胞,HepG2-21單克隆細胞IE

8、R5基因蛋白表達水平明顯增高,HepG2-21為有效的IER5基因過表達細胞模型,定義為IER5-over-expression-HepG2細胞系,其細胞體積比HepG2-Control細胞體積小。
　　 2 IER5基因高表達對細胞增殖的影響:計數(shù)HepG2-Control細胞和IER5-over-expression-HepG2細胞0Gy、2Gy、4Gy C060γ射線照射后1-6天的細胞數(shù),繪制細胞生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn):IE

9、R5-over-expression-HepG2細胞在0Gy、2Gy、4Gy輻射后第3或4天生長速度較對照細胞HepG2-Control開始減慢,第6天時細胞數(shù)明顯少于HepG2-Control(P＜0.05)。
　　 細胞接種后24小時,采流式細胞術(shù)檢測未輻射的HepG2-Control細胞和IER5-over-expression-HepG2細胞在細胞周期不同階段(G0-G1期、G2-M期、S期)的細胞百分率,IER5-ov

10、er-expression-HepG2與HepG2-Control細胞處于S期的細胞百分率分別為(21.80±0.42)％和(29.36±2.08)％,P＜0.05。與之相應,G0-G1期上述兩種細胞百分率分別為(46.96±2.26)％和(47.08±1.26)％,P＞0.05。說明IER5基因過表達,HepG2細胞的增殖能力減弱,與生長曲線結(jié)果一致。
　　 3 IER5基因過表達對離體HepG2細胞細胞周期的影響
　　

11、 4Gy Co60γ射線照射后,流式細胞術(shù)測定細胞周期,結(jié)果發(fā)現(xiàn):IER5-overexperssion-HepG2和HepG2-control細胞經(jīng)4Gy射線照射后12小時G2-M期細胞百分率明顯高于0小時(46.64±3.78)％和(18.98±2.96)％,P＜0.05;(51.00±4.58)％和(20.36±2.26)％,P＜0.05。說明照射后12小時,IER5-overexperssion-HepG2與HepG2-con

12、trol細胞均出現(xiàn)G2-M期阻滯。
　　 輻射后24小時HepG2-control細胞和IER5-overexperssion-HepG2細胞G2-M期細胞百分率均明顯高于0小時((27.85±4.56)％vs(20.36±2.26)％,P＜0.05;(40.64±3.28)％vs(18.98±2.86)％,P＜0.05,且IER5-overexperssion-HepG2組G2-M期細胞百分率明顯高于HepG2-control

13、組(40.64±3.28)％vs(27.85±4.56)％,P＜0.05;此時,IER5-overexperssion-HepG2組S期細胞比例明顯低于HepG2-control組(4.68±2.34)％vs8.04±1.46)％,P＜0.05)。說明IER5基因過表達增加了HepG2細胞發(fā)生G2-M期阻滯的細胞比率,減少了HepG2細胞進入DNA合成期S期的比率,提示IER5基因過表達削弱了HepG2細胞對輻射誘導細胞損傷的修復能力,

14、細胞的抗輻射能力減弱,輻射敏感性增強。
　　 4 IER5基因過表達對離體HepG2細胞細胞凋亡的影響
　　 在2Gy、4Gy Co60γ射線照射下,輻射誘導IER5-over-expression-HepG2、IER5-SiRNA-HepG2(該細胞來源于本實驗組合作成員)、HepG2-control三種細胞的細胞凋亡比例具有顯著性差異(P＜0.05):相同輻射劑量下IER5-over-expression-HepG2

15、比IER5-SiRNA-HepG2和HepG2-control的細胞凋亡比例明顯增高,IER5-SiRNA-HepG2細胞凋亡比例最小。說明IER5基因過表達能促進HepG2細胞凋亡、削弱其抗輻射能力,而IER5基因沉默能減少HepG2細胞凋亡,增加其輻射抗性,提示IER5基因能增加HepG2細胞輻射敏感性,預示該基因可能為HepG2細胞的輻射敏感基因。
　　 結(jié)論:1本研究成功建立了IER5基因高表達的細胞模型:IER5-ov

16、erex perssion-HepG2細胞系,并獲得國家級發(fā)明專利,專利號:200910082178.4。
　　 2 IER5基因高表達可抑制離體HepG2細胞生長、增殖與分裂,促進細胞凋亡。
　　 3 IER5基因過表達削弱了離體HepG2細胞對輻射誘導細胞損傷的修復能力,細胞的抗輻射能力減弱,輻射敏感性增強,預示該基因可能為肝癌的輻射敏感基因。
　　 上述研究結(jié)論提示我們IER5基因可能為肝癌放射治療的“有益