IER5在輻射及順鉑誘導人肝癌HepG2細胞凋亡中的作用.pdf

1、原發(fā)性肝癌，是我國最常見的惡性腫瘤之一，年死亡率居我國惡性腫瘤死亡率第三位。近年來，隨著三維適型放療及調強放療技術的發(fā)展，放療在肝癌治療中發(fā)揮越來越重要的作用。放射治療，簡稱放療，是通過高能放射線照射來殺滅細胞的一種治療方法。放射線輻射細胞后，激活細胞氧化應激反應，導致細胞凋亡。DNA降解是細胞凋亡的一個顯著特征，也是輻射造成細胞損傷的主要目標。增加腫瘤細胞的輻射敏感性，可增加腫瘤的放療療效，輻射敏感性直接作用于細胞周期的G2期，使細胞

2、周期阻滯于G2/M期，阻止細胞有絲分裂，誘導細胞凋亡。輻射敏感性受輻射敏感基因調控，多年來學者們致力于尋找腫瘤的輻射敏感基因，來增加腫瘤細胞的輻射敏感性，進而增強腫瘤的放療療效并減少放療的副作用。
　　 IER5屬于早期慢反應基因，由于IER5在細胞周期中的特定表達，故其在細胞周期調控中起一定作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，輻射可增強IER5的轉錄水平，IER5表達增加可使離體培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞對輻射損傷修復能力減弱，增加HepG

3、2細胞的輻射敏感性。半胱天冬酶(caspase)是細胞凋亡的主要蛋白酶。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能抑制半胱天冬酶-9(caspase-9)的活性，通過依賴和不依賴Caspase選擇性地降低細胞活性致細胞凋亡。
　　 目前關于IER5在輻射誘導細胞凋亡中的作用及作用機制國內(nèi)外尚乏報道。許多化療藥物主要通過激活caspase促進細胞凋亡。順鉑類化療藥物是肝動脈化療栓塞的常用藥物之一。IER5對順鉑誘導肝癌細胞凋亡是否有影

4、響，國內(nèi)外尚無報道。本文采用穩(wěn)定轉染篩選單克隆技術、免疫印記技術、流式細胞術等方法進一步探討IER5與肝癌輻射敏感性之間的關系，研究其在輻射及順鉑誘導HepG2細胞凋亡中的作用及機制，期望為增加肝癌放化療敏感性尋找到新的作用靶點，從而改善肝癌患者的預后及生存質量。
　　 目的：本研究以離體肝癌HepG2細胞為研究對象，采用穩(wěn)定轉染篩選單克隆技術，轉染HepG2，建立IER5基因過表達細胞模型。采用細胞計數(shù)、MTT比色法、流式細胞

5、術及蛋白免疫印跡技術研究IER5在輻射調控HepG2細胞增殖、存活、細胞周期分布及凋亡中的作用及作用機制。同時應用免疫印跡技術對IER5在順鉑誘導人肝癌HepG2細胞凋亡中的作用進行了研究。
　　 方法：
　　 1 構建IER5過表達細胞系：用脂質體2000TM在人肝癌HepG2細胞內(nèi)穩(wěn)定轉染IER5-3xFlag基因或空載體Pcmv-3xFlag Vector，構建穩(wěn)定轉染IER5基因的細胞系（HepG2/IER5），

6、并將轉染空載體的細胞(HepG2/Vector)作為對照組，采用免疫印跡法檢測IER5蛋白表達。
　　 2 研究IER5基因表達增加對輻射后HepG2細胞增殖、存活能力、細胞周期的影響：①將HepG2/IER5細胞和HepG2/Vector細胞分別接受0Gy、4Gy60Co-γ射線照射，應用細胞計數(shù)方法檢測IER5在輻射影響HepG2細胞增殖中的作用。②通過MTT法檢測細胞存活率，研究IER5對輻射后HepG2細胞存活能力的影響

7、。③采用流式細胞術研究IER5對輻射后HepG2細胞細胞周期的影響。
　　 3 研究IER5在γ射線及順鉑誘導HepG2細胞凋亡中的作用及作用機制：采用蛋白免疫印跡方法檢測凋亡蛋白和凋亡通路相關蛋白的表達。
　　 結果：
　　 1 構建IER5過表達細胞系(HepG2/IER5)（見Fig1）：Western Blotting檢測結果顯示：相對于HepG2/Vector細胞，IER5蛋白在HepG2/IER5表達

8、水平明顯升高，說明HepG2/IER5過表達細胞系構建成功。
　　 2 IER5過表達能抑制HepG2增殖并增強輻射對HepG2細胞增殖的抑制作用（見Fig2）：在未照射組及照射組，與HepG2/Vector細胞相比，HepG2/IER5細胞生長速度均明顯減慢(P＜0.05)，說明增加IER5表達能抑制HepG2增殖，增強輻射對HepG2細胞增殖的抑制作用。
　　 3 IER5過表達加強了輻射對HepG2細胞存活的抑制作

9、用（見Fig3）：γ-射線照射后24小時及48小時HepG2/IER5細胞存活率明顯低于HepG2/Vector細胞(P＜0.01)。且輻射后24小時的HepG2/IER5細胞比未照射組HepG2/IER5細胞的存活率亦明顯降低(P＜0.01)。說明增加IER5表達能降低HepG2細胞存活率，增強輻射對HepG2細胞存活的抑制作用。
　　 4 IER5過表達能使輻射后的HepG2細胞周期阻滯在G2/M期（見Fig4）：未照射組細

10、胞及照射組HepG2/Vector細胞在各周期的DNA含量無明顯差異；γ-射線照射后12小時（P＜0.01）和24小時（P＜0.05），HepG2/IER5細胞與對照組相比，隨G0/G1期或S期DNA含量減少，G2/M期DNA含量明顯增加。說明輻射后HepG2/IER5細胞周期被阻滯于G2/M期。
　　 5 IER5過表達能促進γ-射線及順鉑誘導的HepG2細胞凋亡(見Fig5、6):γ-射線照射或順鉑干預后，與HepG2/Ve

11、ctor細胞相比，HepG2/IER5細胞凋亡蛋白cleaved Caspase-3及cleavage PARP表達增強，說明增加IER5表達能促進輻射及順鉑誘導HepG2細胞凋亡。
　　 6 IER5通過增加輻射對Akt磷酸化活性的抑制作用、增加p21表達，促進輻射誘導HepG2細胞凋亡（見Fig5）：γ-射線照射后，與HepG2/Vector細胞相比，HepG2/IER5細胞磷酸化Akt的表達減弱，p21表達增強，說明增加I

12、ER5表達能抑制Akt磷酸化活性、激活p21。
　　 結論：
　　 1 建立IER5過表達細胞系(HepG2/IER5)及對照組細胞系(HepG2/Vector)。
　　 2 增加IER5表達能抑制HepG2細胞增殖，降低HepG2細胞存活率，增強輻射對HepG2細胞增殖、存活、細胞分裂的抑制作用。
　　 3 增加IER5表達能增強輻射及順鉑誘導HepG2細胞凋亡。IER5可通過抑制Akt磷酸化活性，激活