hTERT干擾誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的： 肝癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，原癌基因激活、抑癌基因失活、基因組不穩(wěn)定性以及端粒酶激活在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。其中，端粒酶因其在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中廣泛存在而成為重要的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humanTelomeraseReverseTransciptase，hTERT)是端粒酶的催化亞單位和限速酶，對(duì)端粒酶活性維持起關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)報(bào)道，80％-100％的人肝細(xì)胞癌中hTERT過(guò)度表達(dá)。

2、我們過(guò)去的研究表明，干擾hTERT表達(dá)可降低端粒酶活性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和衰老，但其分子機(jī)制尚不清楚。線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的ATP生產(chǎn)中心，可能在細(xì)胞凋亡控制中起主導(dǎo)作用。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要通過(guò)兩個(gè)方面進(jìn)行調(diào)控：一是保持ATP的產(chǎn)生；二是維持線粒體膜電位和線粒體膜通透性，調(diào)控特定的促凋亡因子從線粒體膜間隙進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)，但人們對(duì)其作用機(jī)制還不十分清楚。鑒于此，我們觀察了經(jīng)hTERTRNA干擾HepG2肝癌細(xì)胞線粒體膜電位變化、4種線粒

3、體膜間隙促凋亡蛋白釋放、端粒酶活性變化以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)改變，希圖對(duì)hTERT干擾通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)凋亡的可能機(jī)制進(jìn)行初步探索。 方法： 1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線； 2、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位； 3、激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位和凋亡細(xì)胞核改變； 4、TRAP法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性變化； 5、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)AIF和EndoG表達(dá)； 6、WesternBl

4、ot檢測(cè)cytC、Smac、Hsp60、AIF、EndoG、caspase-3、caspase-9、hTERT、XIAP、Bcl-2、Bax和Bcl-xl表達(dá)變化。 結(jié)果： 1、與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞和第11代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)略減慢，第20代轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢；三代對(duì)照細(xì)胞組間比較生長(zhǎng)速度無(wú)明顯變化；三代轉(zhuǎn)染細(xì)胞組間相比，第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)最快，第11代次之，第20代明顯減慢；

5、 2、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞相比凋亡細(xì)胞百分比無(wú)顯著差別(P＞0.05)：第20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞百分比明顯增加(P＜0.05)；第20代、第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別與第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞百分比明顯增加(P＜0.05)；第20代、第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞組間相比無(wú)顯著差別(P＝0.051)；HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞組間相比亦無(wú)顯著差別(P＞0.05)； 3、FCM檢測(cè)△ψm

6、，第11代、20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞和其對(duì)照細(xì)胞相比，去極化膜電位百分比明顯增加(P＜0.05)；第11代、20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加去極化膜電位百分比逐漸增加(P＜0.05)；HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞去極化膜電位百分比組間相比無(wú)顯著差別(P＞0.05)； 4、共聚焦顯微鏡觀察△ψm可見(jiàn)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞胞質(zhì)中有大量小短棒狀紅色熒光，幾乎未見(jiàn)綠色熒光；第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)除大量紅

7、色熒光外出現(xiàn)少量綠色熒光；第20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞可見(jiàn)紅色熒光明顯減少，同時(shí)出現(xiàn)大量均勻分布的綠色熒光，第30代綠色熒光比第20代進(jìn)一步增加； 5、第11代、20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞和其對(duì)應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞相比，線粒體cytC表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，胞漿cytC表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；第11代、20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞組間相比無(wú)明顯差別(P＞0.05)；未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞相比亦無(wú)顯著差別(P＞0.05

8、)； 6、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與第11代對(duì)照細(xì)胞相比線粒體和胞漿Smac表達(dá)差別不顯著(P＞0.05)；第20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞和其對(duì)照細(xì)胞相比，線粒體Smac表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，胞漿Smac表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；第30代比第20代轉(zhuǎn)染細(xì)胞線粒體Smac表達(dá)減少(P＜0.05)，胞漿Smac表達(dá)增加(P＜0.05)；未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞相比則無(wú)顯著差別(P＞0.05)； 7、免疫細(xì)胞

9、化學(xué)檢測(cè)AIF、EndoG表達(dá)可見(jiàn)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及第11代、20代和30代對(duì)照細(xì)胞僅在胞漿中可見(jiàn)棕黃色(EndoG)或紅褐色(AIF)著色；第20代、第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞漿和部分胞核中可見(jiàn)棕黃色或紅褐色染色； 8、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與第11代對(duì)照細(xì)胞相比線粒體、胞漿和胞核AIF和EndoG表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)；第20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞和其對(duì)照細(xì)胞相比，線粒體AIF和EndoG表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，

10、胞漿AIF和EndoG表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)，胞核AIF和EndoG表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；第20代與第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比則無(wú)明顯差別(P＞0.05)；未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞相比差別無(wú)顯著性(P＞0.05)； 9、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞相比線粒體、胞漿中Hsp60表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)；第20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞相比，線粒體Hsp60表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，胞漿H

11、sp60表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；第20代與第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比無(wú)明顯差別(P＞0.05)；未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞相比無(wú)顯著差別(P＞0.05)； 10、第11代、20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞相比，hTERT和Bcl-2表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，第11代、20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞間相比無(wú)顯著差別(P＞0.05)；HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

12、05)； 11、HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞、第11代、20代和第30代對(duì)照細(xì)胞端粒酶活性未見(jiàn)明顯改變；第20代、第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞相比，端粒酶活性均下降，且第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞比第20代轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性更低； 12、HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞與第11代、20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，Bcl-xl表達(dá)均無(wú)明顯差別(P＞0.05)； 13、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞相比

13、Bax和Caspase-3表達(dá)無(wú)顯著差別(P＞0.05)；第20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞和其對(duì)照細(xì)胞相比，Bax和Caspase-3表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；第20代、第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞間相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞間相比差別不顯著(P＞0.05)； 14、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞相比XIAP表達(dá)無(wú)顯著差別(P＞0.05)；第20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞相比，

14、XIAP表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，第30代比第20代轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)減少(P＜0.05)；HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞相比差別無(wú)顯著性(P＞0.05)； 15、HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞、第11代、20代、30代對(duì)照細(xì)胞僅見(jiàn)前caspase-9一條帶，第20代、第30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞可見(jiàn)前caspase-9及caspase-9p35亞基兩條帶； 16、HepG2未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、第11代轉(zhuǎn)染細(xì)胞

15、、第11代、第20代、第30代對(duì)照細(xì)胞可見(jiàn)胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布不均勻，核仁明顯；第20代、30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞可見(jiàn)部分細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)變致密，核仁縮小或消失，出現(xiàn)核濃縮和碎裂。 結(jié)論： 1、hTERT干擾促HepG2細(xì)胞凋亡是一個(gè)緩慢的漸進(jìn)過(guò)程。在此過(guò)程中，△ψm下降可能是細(xì)胞凋亡的早期改變(早于細(xì)胞膜和細(xì)胞核改變)，并且一直貫穿于前30代轉(zhuǎn)染細(xì)胞，隨著△ψm逐漸降低，細(xì)胞凋亡逐漸增加； 2、在hTERT干

16、擾促HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中，△ψm降低可能促進(jìn)線粒體IMS促凋亡蛋白由線粒體釋入胞漿，且cytC釋放早于Smac、AIF、EndoG釋放； 3、在hTERT干擾促HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中，△ψm下降早于端粒酶活性降低，推測(cè)hTERT可能存在不依賴端粒酶活性改變的其它機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡； 4、在hTERT干擾促HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2和Bax共同參與線粒體IMS蛋白釋放的調(diào)節(jié)，且Bcl-2可能是Bcl-2家族蛋

17、白通過(guò)線粒體途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的始動(dòng)因素；未見(jiàn)Bcl-xl參與此凋亡過(guò)程； 5、在hTERT干擾促HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體基質(zhì)蛋白Hsp60和線粒體IMS蛋白均由線粒體釋入胞漿，提示IMS蛋白可能通過(guò)PT孔釋放； 6、在hTERT干擾促HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中，cytC和Smac釋放后通過(guò)不同的途徑共同參與caspase-3的激活：釋放的cytC通過(guò)cytC/Apaf-1/procaspase-9途徑活化caspa