hTERT干擾誘導肝癌HepG2細胞凋亡及機制研究.pdf

1、背景和目的： 肝癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的復雜過程，原癌基因激活、抑癌基因失活、基因組不穩(wěn)定性以及端粒酶激活在其發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。其中，端粒酶因其在大多數(shù)腫瘤細胞中廣泛存在而成為重要的腫瘤生物學標志。人端粒酶逆轉錄酶(humanTelomeraseReverseTransciptase，hTERT)是端粒酶的催化亞單位和限速酶，對端粒酶活性維持起關鍵作用。文獻報道，80％-100％的人肝細胞癌中hTERT過度表達。

2、我們過去的研究表明，干擾hTERT表達可降低端粒酶活性，促進肝癌細胞凋亡和衰老，但其分子機制尚不清楚。線粒體是細胞內(nèi)主要的ATP生產(chǎn)中心，可能在細胞凋亡控制中起主導作用。線粒體介導的細胞凋亡主要通過兩個方面進行調控：一是保持ATP的產(chǎn)生；二是維持線粒體膜電位和線粒體膜通透性，調控特定的促凋亡因子從線粒體膜間隙進入到細胞質，但人們對其作用機制還不十分清楚。鑒于此，我們觀察了經(jīng)hTERTRNA干擾HepG2肝癌細胞線粒體膜電位變化、4種線粒

3、體膜間隙促凋亡蛋白釋放、端粒酶活性變化以及凋亡相關蛋白表達改變，希圖對hTERT干擾通過線粒體途徑促進凋亡的可能機制進行初步探索。 方法： 1、MTT法檢測細胞生長曲線； 2、流式細胞儀測定細胞凋亡和線粒體膜電位； 3、激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位和凋亡細胞核改變； 4、TRAP法檢測轉染細胞端粒酶活性變化； 5、免疫細胞化學檢測AIF和EndoG表達； 6、WesternBl

4、ot檢測cytC、Smac、Hsp60、AIF、EndoG、caspase-3、caspase-9、hTERT、XIAP、Bcl-2、Bax和Bcl-xl表達變化。 結果： 1、與未轉染細胞相比，第11代、20代、30代對照細胞和第11代、30代轉染細胞生長略減慢，第20代轉染細胞生長明顯減慢；三代對照細胞組間比較生長速度無明顯變化；三代轉染細胞組間相比，第30代轉染細胞生長最快，第11代次之，第20代明顯減慢；

5、 2、第11代轉染細胞與其對照細胞相比凋亡細胞百分比無顯著差別(P＞0.05)：第20代、30代轉染細胞與對照細胞相比，凋亡細胞百分比明顯增加(P＜0.05)；第20代、第30代轉染細胞分別與第11代轉染細胞相比，凋亡細胞百分比明顯增加(P＜0.05)；第20代、第30代轉染細胞組間相比無顯著差別(P＝0.051)；HepG2未轉染細胞和第11代、20代、30代對照細胞組間相比亦無顯著差別(P＞0.05)； 3、FCM檢測△ψm

6、，第11代、20代、30代轉染細胞和其對照細胞相比，去極化膜電位百分比明顯增加(P＜0.05)；第11代、20代、30代轉染細胞隨著細胞傳代次數(shù)的增加去極化膜電位百分比逐漸增加(P＜0.05)；HepG2未轉染細胞和第11代、20代、30代對照細胞去極化膜電位百分比組間相比無顯著差別(P＞0.05)； 4、共聚焦顯微鏡觀察△ψm可見未轉染細胞和對照細胞胞質中有大量小短棒狀紅色熒光，幾乎未見綠色熒光；第11代轉染細胞胞質內(nèi)除大量紅

7、色熒光外出現(xiàn)少量綠色熒光；第20代、30代轉染細胞可見紅色熒光明顯減少，同時出現(xiàn)大量均勻分布的綠色熒光，第30代綠色熒光比第20代進一步增加； 5、第11代、20代、30代轉染細胞和其對應的對照細胞相比，線粒體cytC表達明顯減少(P＜0.05)，胞漿cytC表達明顯增加(P＜0.05)；第11代、20代、30代轉染細胞組間相比無明顯差別(P＞0.05)；未轉染細胞與第11代、20代、30代對照細胞相比亦無顯著差別(P＞0.05

8、)； 6、第11代轉染細胞與第11代對照細胞相比線粒體和胞漿Smac表達差別不顯著(P＞0.05)；第20代、30代轉染細胞和其對照細胞相比，線粒體Smac表達明顯減少(P＜0.05)，胞漿Smac表達明顯增加(P＜0.05)；第30代比第20代轉染細胞線粒體Smac表達減少(P＜0.05)，胞漿Smac表達增加(P＜0.05)；未轉染細胞和第11代、20代、30代對照細胞相比則無顯著差別(P＞0.05)； 7、免疫細胞

9、化學檢測AIF、EndoG表達可見未轉染細胞、第11代轉染細胞以及第11代、20代和30代對照細胞僅在胞漿中可見棕黃色(EndoG)或紅褐色(AIF)著色；第20代、第30代轉染細胞的胞漿和部分胞核中可見棕黃色或紅褐色染色； 8、第11代轉染細胞與第11代對照細胞相比線粒體、胞漿和胞核AIF和EndoG表達無明顯變化(P＞0.05)；第20代、30代轉染細胞和其對照細胞相比，線粒體AIF和EndoG表達明顯減少(P＜0.05)，

10、胞漿AIF和EndoG表達無明顯變化(P＞0.05)，胞核AIF和EndoG表達明顯增加(P＜0.05)；第20代與第30代轉染細胞相比則無明顯差別(P＞0.05)；未轉染細胞與第11代、20代、30代對照細胞相比差別無顯著性(P＞0.05)； 9、第11代轉染細胞與其對照細胞相比線粒體、胞漿中Hsp60表達無明顯變化(P＞0.05)；第20代、30代轉染細胞與其對照細胞相比，線粒體Hsp60表達明顯減少(P＜0.05)，胞漿H

11、sp60表達明顯增加(P＜0.05)；第20代與第30代轉染細胞相比無明顯差別(P＞0.05)；未轉染細胞與第11代、20代、30代對照細胞相比無顯著差別(P＞0.05)； 10、第11代、20代、30代轉染細胞與其對照細胞相比，hTERT和Bcl-2表達明顯減少(P＜0.05)，第11代、20代、30代轉染細胞間相比無顯著差別(P＞0.05)；HepG2未轉染細胞和第11代、20代、30代對照細胞相比差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.

12、05)； 11、HepG2未轉染細胞、第11代轉染細胞、第11代、20代和第30代對照細胞端粒酶活性未見明顯改變；第20代、第30代轉染細胞與其對照細胞相比，端粒酶活性均下降，且第30代轉染細胞比第20代轉染細胞端粒酶活性更低； 12、HepG2未轉染細胞、第11代、20代、30代對照細胞與第11代、20代、30代轉染細胞相比，Bcl-xl表達均無明顯差別(P＞0.05)； 13、第11代轉染細胞與其對照細胞相比

13、Bax和Caspase-3表達無顯著差別(P＞0.05)；第20代、30代轉染細胞和其對照細胞相比，Bax和Caspase-3表達明顯增加(P＜0.05)；第20代、第30代轉染細胞間相比差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；HepG2未轉染細胞和第11代、20代、30代對照細胞間相比差別不顯著(P＞0.05)； 14、第11代轉染細胞與其對照細胞相比XIAP表達無顯著差別(P＞0.05)；第20代、30代轉染細胞與其對照細胞相比，

14、XIAP表達明顯減少(P＜0.05)，第30代比第20代轉染細胞表達減少(P＜0.05)；HepG2未轉染細胞和第11代、20代、30代對照細胞相比差別無顯著性(P＞0.05)； 15、HepG2未轉染細胞、第11代轉染細胞、第11代、20代、30代對照細胞僅見前caspase-9一條帶，第20代、第30代轉染細胞可見前caspase-9及caspase-9p35亞基兩條帶； 16、HepG2未轉染細胞、第11代轉染細胞

15、、第11代、第20代、第30代對照細胞可見胞核呈圓形或橢圓形，染色質分布不均勻，核仁明顯；第20代、30代轉染細胞可見部分細胞核縮小，染色質變致密，核仁縮小或消失，出現(xiàn)核濃縮和碎裂。 結論： 1、hTERT干擾促HepG2細胞凋亡是一個緩慢的漸進過程。在此過程中，△ψm下降可能是細胞凋亡的早期改變(早于細胞膜和細胞核改變)，并且一直貫穿于前30代轉染細胞，隨著△ψm逐漸降低，細胞凋亡逐漸增加； 2、在hTERT干

16、擾促HepG2細胞凋亡過程中，△ψm降低可能促進線粒體IMS促凋亡蛋白由線粒體釋入胞漿，且cytC釋放早于Smac、AIF、EndoG釋放； 3、在hTERT干擾促HepG2細胞凋亡過程中，△ψm下降早于端粒酶活性降低，推測hTERT可能存在不依賴端粒酶活性改變的其它機制調節(jié)細胞凋亡； 4、在hTERT干擾促HepG2細胞凋亡過程中，Bcl-2和Bax共同參與線粒體IMS蛋白釋放的調節(jié)，且Bcl-2可能是Bcl-2家族蛋

17、白通過線粒體途徑調節(jié)細胞凋亡的始動因素；未見Bcl-xl參與此凋亡過程； 5、在hTERT干擾促HepG2細胞凋亡過程中，線粒體基質蛋白Hsp60和線粒體IMS蛋白均由線粒體釋入胞漿，提示IMS蛋白可能通過PT孔釋放； 6、在hTERT干擾促HepG2細胞凋亡過程中，cytC和Smac釋放后通過不同的途徑共同參與caspase-3的激活：釋放的cytC通過cytC/Apaf-1/procaspase-9途徑活化caspa