HSPA9抑制Apoptin誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡.pdf

1、VP3/Apoptin 是源自雞貧血病毒的一種小分子蛋白質(zhì)，能特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。早期的研究提示，VP3(108位絲氨酸)的磷酸化及核定位是其特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的首要條件，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。后來，相繼發(fā)現(xiàn)了數(shù)種與VP3 相互作用的蛋白質(zhì)，如：N-myc interacting protein (NMI)，promyelocytic leukemia protein(PML)，anaphase promoting comp

2、lex/cyclosome subunit 1 (APC/C)，death effectordomain associated factor (DEDAF)，SUMO，Acid ceramidase，CRM1，imprtin-β1，Acidceramidase，Ppil3等，這些蛋白質(zhì)與VP3特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)；有研究提示：VP3(108位蘇氨酸)的磷酸化并非其特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的必要條件。最近，Maddika等報道，C

3、DK2 是磷酸化修飾VP3(108位蘇氨酸)的激酶，VP3與PI3K的p85亞基相互作用別構(gòu)激活PI3K，活化后的PI3K 激活A(yù)kt，Akt 能與VP3 共定位于核內(nèi)，Akt 進(jìn)一步激活CDK2，活化后的CDK2 磷酸化修飾VP3。這些研究對VP3特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制有了新的認(rèn)識。同時也提示，進(jìn)一步探討和鑒定VP3 在細(xì)胞中與之相互作用的蛋白，通過分析研究這些蛋白質(zhì)在與VP3 相互作用后其功能的改變，對闡明VP3的腫瘤特異性凋

4、亡激活機(jī)制具有非常重要的意義。
　　 本研究以His-VP3 融合蛋白為誘餌，通過pull-dawn 技術(shù)，捕獲His-VP3 在腫瘤細(xì)胞HepG2與正常細(xì)胞L-02中相互作用的蛋白，應(yīng)用二維電泳技術(shù)分離捕獲蛋白質(zhì)，通過軟件分析比較HepG2和L-02細(xì)胞中與VP3 相互作用蛋白質(zhì)的差異，從膠上切取這些蛋白質(zhì)點，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出這些有差異的相互作用蛋白質(zhì)。
　　 HSPA9 是在體外捕獲的相互作用蛋白質(zhì)之一，HSPA9（

5、mortalin）是熱休克蛋白70（hsp70）家族成員之一，與細(xì)胞的各項生理活動密切相關(guān)，其功能主要與延長細(xì)胞壽命、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、線粒體產(chǎn)能、分子伴侶、原癌基因轉(zhuǎn)化、使腫瘤細(xì)胞低分化和應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)。HSPA9 在腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)水平均高于正常細(xì)胞或組織。在正常細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)HSPA9可有效延長細(xì)胞壽命；抑制HSPA9的表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞衰老或凋亡。HSPA9 在細(xì)胞內(nèi)可與多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，如HSPA9與HSP60（線粒

6、體內(nèi)分子伴侶蛋白）的相互作用是維持腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖的條件之一。
　　 HSPA9 是線粒體內(nèi)的主要蛋白質(zhì)之一，負(fù)責(zé)精確調(diào)控線粒體蛋白質(zhì)的輸入和輸出，對維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和線粒體產(chǎn)能至關(guān)重要。酵母細(xì)胞內(nèi)敲除HSPA9 同源蛋白Ssc1可致細(xì)胞死亡，Ssc1 功能域缺失或突變可致酵母細(xì)胞內(nèi)的線粒體聚集。HSPA9 在細(xì)胞內(nèi)是一種抗凋亡蛋白。所以在我們所鑒定出的相關(guān)蛋白質(zhì)中，選取HSPA9作為進(jìn)一步研究的靶蛋白。
　　 VP3和H

7、SPA9的相互作用經(jīng)免疫共沉淀方法在胞內(nèi)得到證實。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞內(nèi)過表HSPA9時，觀察到VP3的核質(zhì)分布發(fā)生了改變，部分VP3滯留于細(xì)胞質(zhì)中；HepG2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)HSPA9檢測其對VP3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，在我們檢測的時間點（24h）上，共轉(zhuǎn)染了VP3和HSPA9的HepG2細(xì)胞凋亡率顯著下降；與之相反，當(dāng)我們si-RNA降低HSPA9 在HepG2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量時，VP3對HepG2細(xì)胞的殺傷作用顯著

8、增加。以上結(jié)果表明：HSPA9 是VP3的相互作用蛋白質(zhì)之一；過表達(dá)HSPA9可致部分VP3 滯留細(xì)胞質(zhì)中；HSPA9的表達(dá)水平可顯著抑制VP3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。
　　 目前對于VP3特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不十分清楚，已有的研究表明，VP3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過內(nèi)源性凋亡途徑，不依賴死亡受體途徑，其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性的發(fā)揮與其核定位密切相關(guān)。S. Maddika等證實，經(jīng)VP3處理的腫瘤細(xì)胞，VP3聚集于核內(nèi)，導(dǎo)

9、致orphan steroid receptor Nur77從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，Nur77與線粒體膜上的抗凋亡蛋白質(zhì)發(fā)生作用，降低線粒體膜電位，激活線粒體凋亡途徑。
　　 Nur77的核質(zhì)轉(zhuǎn)移是VP3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。我們的結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)HSPA9，使VP3的核質(zhì)分布發(fā)生改變，胞質(zhì)中滯留的VP3增多，進(jìn)而降低了VP3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的效率；當(dāng)抑制HSPA9的表達(dá)時，VP3幾乎全部聚集

10、于細(xì)胞核內(nèi)，提高了VP3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡率。這表明：HSPA9抑制VP3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)是通過改變VP3的核質(zhì)分布實現(xiàn)的。
　　 胞內(nèi)過表達(dá)或抑制HSPA9，可能從兩個方面影響了VP3對HepG2細(xì)胞的殺傷作用，一方面，過表達(dá)時VP3進(jìn)入細(xì)胞核的量減少，使Nur77從核內(nèi)轉(zhuǎn)移出胞質(zhì)量減少，減弱了VP3的毒性作用；以此同時，過量表達(dá)的HSPA9增強(qiáng)了線粒體對抗各種凋亡因子的刺激作用。與之相反，在HepG2細(xì)胞內(nèi)抑制HS