從線粒體途徑研究川芎嗪誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡效應(yīng)機(jī)制.pdf

1、惡性腫瘤是人類健康面臨的重大問(wèn)題之一。目前放療、化療等治療方法仍然存在副作用大、耐藥等問(wèn)題。因此，尋找防治腫瘤有效藥物成為當(dāng)務(wù)之急。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）具有多種藥理活性，如抗氧化、改善微循環(huán)及抗腫瘤等[1]。近年來(lái)，川芎嗪抗腫瘤作用日益受到關(guān)注，但圍繞川芎嗪誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制需進(jìn)一步探索。線粒體是細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞器。線粒體途徑凋亡(Mitochondrial pathway of ap

2、optosis)主要是線粒體上游信號(hào)分子啟動(dòng)后作用于線粒體膜，線粒體膜的功能狀態(tài)改變引起B(yǎng)cl-2蛋白家族活化，線粒體PT孔（Permeability transition pore，PT）打開(kāi)，色素細(xì)胞c(Cytochrome c，Cyt-c)啟動(dòng)釋放，引起含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartatespecific proteinase，Caspase)蛋白家族活化，促使細(xì)胞凋亡。
　　目的：通過(guò)Ce

3、ll Counting Kit-8（CCK-8）法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖抑制并篩選靶腫瘤細(xì)胞株。探討川芎嗪誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡量效關(guān)系、時(shí)效關(guān)系以及影響線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)及功能變化。重點(diǎn)研究川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡、線粒體功能及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討川芎嗪抑制HepG2細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，探索從線粒體途徑揭示川芎嗪誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡效應(yīng)機(jī)制。
　　方法：采用CCK-8法觀察川芎嗪對(duì)HepG2、A549、SMMC-7721、MCF-7、M

4、CF-10A、L-O2、及BEAS-2B細(xì)胞增殖抑制作用。通過(guò)IC50及靶向作用效果篩選出HepG2細(xì)胞，并觀察川芎嗪抑制HepG2增殖作用及量效關(guān)系。通過(guò)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)觀察川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制能力的影響。流式細(xì)胞技術(shù)觀察川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。通過(guò)全自動(dòng)蛋白系統(tǒng)，觀察川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞P53蛋白以及Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響。高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞Cyt-c的釋放以及線粒體跨膜電

5、位的影響;通過(guò)全自動(dòng)蛋白分析系統(tǒng)，觀察川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞cleaved-Caspase-3及cleaved-Caspase-9的蛋白表達(dá)的影響，以期探討川芎嗪誘導(dǎo)HepG2凋亡效應(yīng)機(jī)制。
　　結(jié)果：1.川芎嗪抑制HepG2細(xì)胞增殖。10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL及400μg/mL組抑制率與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，且200μg/mL及400μg/mL組抑制率高于

6、陽(yáng)性藥組。川芎嗪干預(yù)HepG2細(xì)胞12、24和48h后均能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖(P＜0.01)。川芎嗪干預(yù)HepG2細(xì)胞后能顯著降低細(xì)胞核大小(P＜0.05)，顯著增加AnnexinⅤ-FITC（P＜0.01）和PI(P＜0.01)熒光值。川芎嗪能顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，呈量效、時(shí)效相關(guān)。
　　2.川芎嗪顯著影響HepG2細(xì)胞周期。100μg/mL川芎嗪干預(yù)HepG2細(xì)胞12h后，能顯著增加HepG2細(xì)胞處于G0/G1

7、期的數(shù)量(P＜0.01)。100μg/mL川芎嗪干預(yù)HepG2細(xì)胞24h和48h后，HepG2細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加(P＜0.01)。
　　3.川芎嗪顯著增加Cyt-c轉(zhuǎn)位(P＜0.01);顯著降低線粒體膜電位(P＜0.05)。顯著增加cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。100μg/mL川芎嗪干預(yù)HepG2細(xì)胞使得p53蛋白的表達(dá)顯著上升（P＜0.01）。100μg/mL

8、川芎嗪干預(yù)HepG2細(xì)胞使得Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比率顯著下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論：1.川芎嗪對(duì)HepG2、A549、SMMC-7721及MCF-7等腫瘤細(xì)胞細(xì)胞增殖有抑制作用。
　　2.川芎嗪對(duì)HepG2增殖抑制呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，IC50劑量低，抑制作用顯著。
　　3.川芎嗪干預(yù)HepG2細(xì)胞12h主要誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯;作用24h和48h后能夠顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。
　　4.川