ROS改變和線粒體損傷在PIG11高表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:建立穩(wěn)定高表達(dá)PIG11(p53-induced protein11,p53誘導(dǎo)基因11)蛋白的HepG2細(xì)胞株,研究PIG11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的ROS(reactive oxygen species,活性氧)和線粒體改變,闡明PIG11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　方法:采用本課題組已凍存的pLXSN-PIG11逆轉(zhuǎn)錄病毒液,在polybrene協(xié)助下感染HepG2細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)PIG11蛋白的Hep

2、G2細(xì)胞,Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定感染后HepG2細(xì)胞PIG11蛋白的表達(dá)情況。DNA Ladder、PI染色流式檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。用Rh123(rhodamine123)標(biāo)記,流式測(cè)定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,Δψm)。Western Blot檢測(cè)胞漿和線粒體組分中Cyt C的含量變化。DCFH-DA熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)ROS,流式檢測(cè)ROS水平的改變。

3、>　　結(jié)果:成功建立穩(wěn)定高表達(dá)PIG11蛋白的HepG2細(xì)胞株,Western Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)證實(shí)PIG11蛋白高表達(dá)。PI染色流式凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞凋亡率為18.60％±1.25,高于HepG2組(3.81%±0.46)和pLXSN-HepG2組(6.03%±0.97)(P<0.01)。pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞可見明顯的DNA Ladder條帶,而HepG2組和pLXSN-

4、HepG2組細(xì)胞均未見明顯的DNA ladder出現(xiàn)。
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)Rh123熒光強(qiáng)度,結(jié)果顯示:pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度(5.4±0.15)顯著低于HepG2細(xì)胞(14.7±0.56)和pLXSN-HepG2細(xì)胞(13.2±0.53)(P<0.01)。用CsA(10μM)抑制各組細(xì)胞的線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)后

5、,流式凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞凋亡率明顯降低。Cyt C的Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在線粒體損傷及之后的Cyt C向胞漿釋放。
　　流式測(cè)定胞內(nèi)ROS水平變化,結(jié)果顯示pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平(15.60±0.92)明顯高于pLXSN-HepG2細(xì)胞(4.90±0.70)和HepG2細(xì)胞(5.37±1.17)(P<0.01)。NAC(10mM)清除各組細(xì)胞內(nèi)的ROS后

6、,流式凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示清除胞內(nèi)ROS的pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞凋亡率(7.75%±0.34)較未清除ROS的pLXSN-PIG11-HepG2細(xì)胞凋亡率(18.60%±1.25)有明顯降低。CsA(10μM)抑制各組細(xì)胞的MPTP后,pLXSN-PIG11-HepG2組ROS降低至8.10±0.30(P<0.05)。
　　結(jié)論:成功獲得穩(wěn)定高表達(dá)PIG11蛋白的HepG2細(xì)胞株;PIG11高表達(dá)可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋