線粒體損傷在α粒子致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、目的：探討并驗證線粒體功能改變和線粒體DNA突變在α粒子致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用機制。
　　 方法：⑴建立α粒子體外照射致人小氣道上皮細(xì)胞 (Small airway epithelial cells，SAEC)惡性轉(zhuǎn)化的模型。不同劑量(0.2、0.4、0.8、1.0、2.0Gy)α粒子分單次和多次照射SAEC細(xì)胞，平板克隆形成試驗檢測不同劑量α粒子對SAEC細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)影響。細(xì)胞照射后常規(guī)培養(yǎng)于37℃，5[％] CO2培養(yǎng)箱中

2、，定期檢測細(xì)胞對血清和PALA的抵抗性以及細(xì)胞的增殖活性。同時檢測細(xì)胞在軟瓊脂中的錨著獨立生長能力，Transwell小室觀察細(xì)胞的侵襲特性，Western blot法測定癌基因c-myc和抑癌基因p53的蛋白表達(dá)。選擇具有惡性轉(zhuǎn)化特性的細(xì)胞接種裸鼠，觀察裸鼠體內(nèi)的成瘤情況。⑵檢測惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中線粒體功能與線粒體DNA的突變情況。以12S rRNA擴(kuò)增線粒體DNA，18S rRNA(GAPDH)擴(kuò)增核DNA，Real-time PCR檢

3、測細(xì)胞的線粒體DNA相對拷貝數(shù)。采用巢式PCR聯(lián)合Real-time PCR檢測細(xì)胞線粒體的Common deletion缺失率。生化試劑盒和Western blot檢測細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase，COX)活性和蛋白的表達(dá)。JC-1熒光探針流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的線粒體膜電位。氧電極法檢測細(xì)胞的氧耗量情況。以軟瓊脂克隆形成率、c-myc為自變量，SPSS17.0軟件分析線粒體拷貝數(shù)、common d

4、eletion缺失率、COX活性、膜電位、氧耗量與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度的相關(guān)性。⑶通過大鼠吸入試驗驗證細(xì)胞的體外染毒結(jié)果。Wistar大鼠置于多功能生態(tài)氡室慢性吸入染毒，累積染毒劑量分別達(dá)100、200、400工作水平月(Working level month，WLM)，組織病理學(xué)HE染色和masson膠原纖維染色觀察氡致大鼠肺組織的病理學(xué)改變。分離大鼠肺組織線粒體，生化試劑盒測定線粒體COX活性，并與病理學(xué)改變作相關(guān)分析。
　　

5、結(jié)果：①細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯示隨α粒子照射劑量增大細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)逐漸降低，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。照射后培養(yǎng)過程中，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)轉(zhuǎn)化特性，血清抗性和PALA抗性以及細(xì)胞增殖活性顯著增加，出現(xiàn)生長接觸抑制。首次照射后4個月，照射組細(xì)胞具備明顯的錨著獨立生長能力，可形成軟瓊脂克隆，其中0.8Gy組克隆形成率最高，形成的克隆也最大。侵襲試驗顯示照射組細(xì)胞侵襲能力明顯增強，同時癌基因c-myc蛋白表達(dá)明顯升高，而野生型抑癌蛋白p53減少或消失，表明照射組細(xì)胞

6、已發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。裸鼠接種試驗，細(xì)胞接種后4個月，0.8Gy多次照射組5只裸鼠有3只在接種部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)，組織病理鑒定為上皮源性腫瘤。②Real-time PCR結(jié)果顯示各轉(zhuǎn)化組細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)增加1.4-2.9倍，common deletion缺失率升高2.6-4.9倍。線粒體功能檢測顯示COX的整體活性下降，COX1和COX4的蛋白表達(dá)均降低，線粒體膜電位下降，細(xì)胞氧耗量降低。相關(guān)性分析顯示線粒體拷貝數(shù)、common deletion缺

7、失率、COX活性與軟瓊脂克隆形成率和c-myc表達(dá)之間呈有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)。③大鼠肺組織病理結(jié)果，與正常對照組相比，可見氡染毒組肺間質(zhì)充血水腫，肺泡間隔增厚，炎癥細(xì)胞浸潤，包括中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等，肺組織逐漸發(fā)生纖維化，肺泡腔逐漸萎縮變小。軟件分析結(jié)果顯示肺泡間隔厚度逐漸增加，平均肺泡腔面積逐漸減少，COX活性測定結(jié)果顯示其活性隨著氡染毒劑量的增加逐漸降低。相關(guān)性分析顯示肺泡隔厚度與COX活性呈負(fù)相關(guān)，而肺泡腔面積與COX活