線粒體損傷在NAFL大鼠肝細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:通過研究線粒體損傷在大鼠NAFL肝細胞凋亡中的作用,探討NAFL的發(fā)病機理.方法:(1)30只Wistar雄性大鼠隨機分為基礎飼料組(正常對照組,C組)、高脂飼料組( 脂肪肝組,F組),其中每組各含4周、8周、12周3個時相點,每時相點5只動物.(2)動態(tài)觀察各組:①體重變化;②HE染色光鏡觀察肝臟組織病理改變;③電鏡觀察肝細胞超微結構變化;④Clark氧電極檢測肝臟線粒體呼吸功能,熒光分光光度計測定線粒體膜電位;⑤硫代巴比妥酸法

2、測定肝臟組織丙二醛(MDA)的含量變化;⑥流式細胞儀檢測肝細胞凋亡百分數(shù);⑦免疫組織化學法及Western blot檢測Cyt C、Caspase-3、Bcl-2、Bax在肝臟中的表達.結果:①體重情況: F組4周、8周、12周,體重分別為355.5±28.3g、406.2±14.5g、469.7±28.9g,而C組為244.9±16.9g、282.5±20.1g、300.7±15.8g,F組體重均高于同一時相點的對照組,差異具有顯著性

3、(P<0.01);②HE染色結果顯示:C組大鼠肝臟無異常發(fā)現(xiàn);F組肝臟在4周時出現(xiàn)脂肪變, 8周出現(xiàn)輕度脂肪肝,12周出現(xiàn)中、重度脂肪肝;電鏡下觀察高脂12周肝組織,肝細胞線粒體腫脹,嵴變短、減少甚至消失,并發(fā)現(xiàn)染色質濃染,邊集于核膜;③F組大鼠肝臟線粒體RCR(呼吸控制率)、P/O(磷/氧比值)比值隨飼養(yǎng)時間的延長逐漸下降,高脂4、8、12周RCR分別為:4. 84±0.18、3.87±0.44、3.51±0.18,C組4、8、12周

4、RCR分別是:4.74±0.38、4.93±0.79、4.85±0.47,F組4周與C組4周無顯著差異,而F組8、12周與相應時相C組比較,RCR顯著降低(P<0.05或P<0.01), F組4、8、12周P/O比值3.61±0.39、3.56±0.34、3.37±0.25較C組相應時相點(4.22±0.63、4.11±0.29、4.13±0.39)均降低,具有顯著性意義(P<0.05或P<0.01); ④C組4、8、12周線粒體膜電位

5、相對熒光強度分別為951.2±64.6、977.2±78.3、958.6±70.4,組間無明顯差異,而高脂4、8、12周線粒體膜電位相對熒光強度分別833.1±53.5、772.2±73.4、587.2±63.1,呈逐漸下降趨勢,與相應時相C組比較明顯降低,差異顯著(P<0.05或P<0.01);⑤第4周后肝臟內MDA含量在F組明顯高于對照組(P<0.05),隨時間延長,F組MDA逐漸增加;⑥F組4周肝細胞凋亡百分數(shù)(4.2±0.4)與

6、C組肝細胞(4.1±0.3)無明顯差異,但F組8周、12周肝細胞凋亡百分數(shù)明顯增加,分別為9.2±0.4、11.6±1.1,C組8、12周分別為4.3±0.3、4.3±0.2,具有顯著差異(P<0.01);⑦免疫組織化學染色顯示:Cyt C在C組肝細胞胞漿中呈黃色細顆粒,均勻分布,在F組隨著時間延長,染色加深,呈片狀分布,范圍擴大.Caspase-3在C組肝臟中呈散在分布,胞漿內著色,弱陽性,F組4周散在分布,著色較正常加深,F組8、1

7、2周著色逐漸加深,陽性細胞數(shù)增加,呈現(xiàn)彌漫陽性;Bcl-2、Bax在C組的表達均為散在弱陽性,F組4、8、12周陽性細胞數(shù)漸增加,并在脂肪變明顯的部位著色深;⑧Western blot檢測結果顯示:F組Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表達隨著時間延長增高,尤以F組8周及12周增加明顯,與C組比較,差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01);隨著脂肪肝的進展,Bcl-2 / Bax比率逐漸下降,Cyt C在F組4周、8周、1

8、2周較C組明顯增加(P<0.05),但F組間比較無明顯差異.結論:1、NAFL大鼠肝細胞凋亡在NAFL的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,脂肪變越重、炎癥越明顯的肝組織,肝細胞凋亡越多;2、肝臟線粒體功能損傷在NAFL發(fā)病機制中起關鍵作用,肝臟脂肪變程度越重,其線粒體功能損傷越明顯,并在單純性脂肪肝向脂肪性肝炎進展的過程中起重要作用;3、線粒體呼吸功能損傷后引起的脂質過氧化、氧應激,引發(fā)了線粒體膜電位下降,啟動了Cyt C由線粒體向胞漿內釋放,