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文檔簡介
1、嚴重的創(chuàng)傷、感染可導致機體炎癥反應失控,最終引發(fā)內毒素血癥及肝功能衰竭。研究表明,黃連(Rhizoma Coptis,RC)具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、止痛、降血糖、保肝解毒等諸多生物學活性,但其對LPS引起的肝細胞損傷的保護及其作用機制尚未見報道。故本試驗以黃連(RC)水提物為試驗藥物、地塞米松(Dexamethasone,DEX)為陽性對照藥物、體外培養(yǎng)的大鼠肝細胞(BRL cells)為靶細胞,采用脂多糖(LPS)構建肝細胞損
2、傷模型后,進行以下幾方面的研究:CCK-8法篩選RC的無毒濃度及LPS的損傷濃度,CCK-8法檢測RC與LPS共同作用于BRL細胞24 h時細胞存活率,流式細胞術檢測BRL細胞凋亡率,RT-PCR檢測TLR4上的NF-κB、IRF3兩條信號傳導通路上mRNA相對表達量變化,熒光倒置顯微鏡觀察NF-κB p65蛋白核轉移等。結果如下:
?。?)篩選RC的無毒濃度及LPS的損傷濃度:RC的無毒濃度為0.175 mg/mL, LPS的
3、損傷濃度為0.1 mg/mL;同時發(fā)現(xiàn),RC濃度在0.0625~0.125 mg/mL時對BRL細胞有促增值作用。經再次篩選,認為0.1 mg/mL RC促增殖作用最好。
?。?)RC與LPS共同作用于BRL細胞24 h時細胞存活率檢測:CCK-8結果表明,與LPS處理組相比,RC在0.175 mg/mL時能使BRL細胞存活率從73.79%增加至81.62%;0.1 mg/mL時能使BRL細胞存活率升高至91.23%。即RC濃度
4、為0.1 mg/mL時,保護作用較好。
?。?)細胞凋亡率檢測:BRL細胞正常對照組、LPS處理組、0.175 mg/mL RC+LPS干預組、0.1 mg/mL RC+LPS干預組、0.0001 mg/mL Dex+LPS陽性對照組的總凋亡率(%)分別為:0.32±0.04、19.26±0.65、16.43±0.73、9.33±0.47、6.34±0.43。RC干預組與LPS處理組比較,細胞總凋亡率顯著下降(p<0.01),其
5、中,RC為0.1 mg/mL能使BRL細胞凋亡率由19.26%降低至9.33%??梢奟C能有效抑制LPS誘導的BRL細胞凋亡,且RC在0.1 mg/mL時效果更好。
(4)熒光定量PCR檢測:與正常對照組相比,LPS處理組可使TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IRF3 mRNA的表達顯著上升(p<0.05),說明LPS誘導的損傷通過TLR4/NF-κB通路和TLR4/IRF3通路,最終導致炎性因子IL-1
6、β、IL-6、TNF-α釋放,從而損傷肝細胞;與LPS處理組相比,RC干預組均可抑制上述基因表達上調(p<0.05),對肝細胞損傷起到保護作用,其機制與TLR4/NF-κB通路和TLR4/IRF3通路有關。
(5)免疫熒光檢測:BRL細胞正常對照組中,F(xiàn)ITC標記的NF-κB p65蛋白主要分布在細胞質中,顯現(xiàn)綠色熒光,DAPI染色后細胞核呈藍色熒光;LPS處理的BRL細胞,胞質中綠色熒光減弱,胞核顏色由深藍色變?yōu)闇\綠色;經R
7、C處理后,BRL細胞核顏色變?yōu)椴煌潭鹊乃{綠色。該結果表明,在LPS作用下部分NF-κB p65蛋白由細胞質轉移到了細胞核,而RC干預組均可不同程度的抑制LPS誘導的NF-κB p65核轉移,且RC在0.1 mg/mL時效果明顯。
結論:黃連對LPS誘導的大鼠肝細胞損傷具有明顯保護作用,能顯著改善細胞生長狀態(tài),減輕 LPS導致的細胞毒性,降低細胞凋亡率。其機制為,黃連可以影響TLR4信號通路,阻礙NF-κB和IRF3通路激活,
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