
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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:嚴(yán)重創(chuàng)傷、全身感染、肝病以及眾多的危重疾病在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都可發(fā)生腸源性?xún)?nèi)毒素血癥,損傷肝細(xì)胞,引發(fā)肝衰竭。臨床研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于重癥監(jiān)護(hù)、燒傷、膿毒血癥及感染性休克等危重疾病患者給予胰島素強(qiáng)化治療可改善病人癥狀,降低病人死亡率及其合并癥的發(fā)生率,但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)探討胰島素對(duì)于內(nèi)毒素血癥中肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制,期望為臨床上肝病治療研究提供新的思路。 方法:①設(shè)正常對(duì)照組及10,20,40,80μ
2、g/ml四個(gè)LPS濃度組,各濃度設(shè)12,24,36,48 h四個(gè)干預(yù)時(shí)間,采用MTT比色法對(duì)各LPS損傷濃度和作用時(shí)間進(jìn)行篩選。②設(shè)正常對(duì)照組、LPS損傷組(20μg/ml)、不同濃度(2.5,5,10,20 IU/ml)的胰島素保護(hù)組及對(duì)照組,各濃度設(shè)12,24,36,48 h四個(gè)干預(yù)時(shí)間,采用MTT比色法對(duì)各組細(xì)胞的存活率進(jìn)行檢測(cè)。③Annexin—V/PI雙染法檢測(cè)正常對(duì)照組、LPS損傷組(20μg/ml)、不同濃度的胰島素(2.
3、5,5,10,20 IU/ml)保護(hù)組各組24 h細(xì)胞凋亡率。④實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)正常對(duì)照組、LPS損傷組(20μg/ml)、不同濃度(2.5,5,10,20 IU/ml)的胰島素保護(hù)組凋亡相關(guān)基因bcl—2,bax和凋亡相關(guān)蛋白Caspase—3的基因表達(dá)情況。 結(jié)果:⑴經(jīng)MTT比色法檢測(cè),LPS對(duì)HL7702細(xì)胞具有損傷作用,其誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的降低具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。10,20,40,80μg/ml LPS處理12,24
4、,36,48 h后與正常對(duì)照組相比,細(xì)胞存活率均有顯著性差異(P<0.01)。而加入2.5,5,10,20 IU/ ml胰島素共同培養(yǎng)12,24,36,48 h后,可減少細(xì)胞死亡率,提高細(xì)胞存活率,各濃度及各作用時(shí)間與20μg/ml LPS損傷組相比,有顯著性差異(P<0.01)。⑵Annexin—V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示,20μg/ml LPS處理24 h后,凋亡細(xì)胞的比例為28.83±1.32%,與正常對(duì)照組9.38±0
5、.39%相比是增加的(P<0.01),而加入2.5,5,10,20 IU/ml胰島素處理后,凋亡細(xì)胞比例分別降至:23.33±1.15%,20.76±1.21%,14.61±0.91%和12.30±1.23%,與20μg/ml LPS損傷組相比有顯著性差異(P<0.01)。⑶實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示,20μg/ml LPS處理24 h后,與正常對(duì)照組相比,細(xì)胞的bcl—2 mRNA表達(dá)(0.56±0.12)顯著降低(P<0.01),
6、bax mRNA表達(dá)(1.37±0.08)和Caspase—3 mRNA表達(dá)(0.95±0.10)顯著升高(P<0.01)。胰島素可減輕bcl—2 mRNA表達(dá)下降與bax,Caspase—3 mRNA表達(dá)升高的程度,且這種影響呈劑量依賴(lài)性。經(jīng)2.5,5,10,20 IU/ml胰島素處理后,細(xì)胞bcl—2 mRNA表達(dá)分別增至:0.76±0.10,0.89±0.08,1.01±0.17和1.20±0.14;bax mRNA表達(dá)分別降至:
7、1.21±0.16,1.02±0.10,0.91±0.06和0.78±0.05;Caspase—3 mRNA表達(dá)分別降至:0.81±0.05,0.72±0.04,0.58±0.38和0.49±0.05,除外2.5 IU/ml胰島素保護(hù)組外,其他劑量胰島素保護(hù)組基因的表達(dá)與20μg/ml LPS損傷組相比均有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論:①LPS可以損傷體外培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞HL7702細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡。②胰島素能抑制LPS
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