Chemerin對(duì)心肌胰島素抵抗的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖引起胰島素抵抗為主要標(biāo)志的代謝紊亂綜合征，可導(dǎo)致多種并發(fā)癥，比如糖尿病腎病，糖尿病視網(wǎng)膜病變，糖尿病心肌病。脂肪組織是一種內(nèi)分泌器官，可分泌多種脂肪因子，如脂聯(lián)素、瘦素、內(nèi)脂素、IL-6等。大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，脂肪因子影響多種組織的葡萄糖代謝。Chemerin又被稱為維甲酸受體反應(yīng)元件2（retinoicacid receptor responder protein2，RA

2、RRES2）或者他扎羅汀誘導(dǎo)基因2(Tazarotene-induced gene2，TIG2)，是最近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，與炎癥，脂肪代謝和胰島素抵抗等具有相關(guān)性。已有研究證明，Chemerin及其受體—趨化因子樣受體1（chemokine-like receptor1，CMKLR1或ChemR23）在許多組織中表達(dá)，特別是在白色脂肪組織、肝臟和腎臟中表達(dá)較。目前的研究顯示，人類血漿chemerin的高表達(dá)是炎癥和代謝綜合癥的標(biāo)志物之

3、一。因此，Chemerin可能參與了胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生發(fā)展。
　　然而，在不同的細(xì)胞中，chemerin在胰島素抵抗中發(fā)揮的作用尚存爭(zhēng)議。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)人類骨骼肌細(xì)胞雖然不表達(dá)chemerin，但是表達(dá)chemerin的受體CMKL1。Chemerin通過破壞胰島素信號(hào)，可誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。但是，在體外3T3-L1細(xì)胞的研究中尚存爭(zhēng)議。Takahashi等發(fā)現(xiàn)chemerin能夠促進(jìn)胰島素刺激下的3T3-L1

4、細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，而Kralisch S等發(fā)現(xiàn)chemerin抑制胰島素刺激下3T3-L1細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取率的增加。這種相反結(jié)果的產(chǎn)生可能與chemerin同時(shí)參與胰島素作用的靶組織對(duì)胰島素敏感性的負(fù)性調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　國外已有研究證實(shí)大鼠心臟組織表達(dá)chemerin及其受體CMKLR1，但是尚無體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道心肌細(xì)胞表達(dá)chemerin以及chemerin在心肌細(xì)胞胰島素抵抗中的作用。糖尿病心肌病是糖尿病的一個(gè)重要并發(fā)癥，因此我

5、們從細(xì)胞水平研究在心肌細(xì)胞中chemerin/ChemR23系統(tǒng)與胰島素抵抗的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)SD乳鼠原代心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞，檢測(cè)心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞是否表達(dá)chemerin，并探討心肌細(xì)胞chemerin的表達(dá)與胰島素抵抗的關(guān)系及其分子學(xué)機(jī)制。本研究主要包括以下四部分:
　　第一部分、Chemerin在乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:購買出生2～3天的SD乳鼠，成功提取并培養(yǎng)SD乳鼠原代心肌細(xì)

6、胞和心臟成纖維細(xì)胞，觀察其是否表達(dá)chemerin，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞，應(yīng)用Real-Time-PCR、Western-Blot技術(shù)觀察心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞是否表達(dá)chemerin。
　　結(jié)果:Real-Time-PCR結(jié)果示乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞均有chemerin mRNA的表達(dá)。Western-Blot結(jié)果示乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成

7、纖維細(xì)胞均有chemerin蛋白的表達(dá)結(jié)論: SD乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞正常情況下均能夠表達(dá)chemerin。
　　第二部分、高糖和炎癥環(huán)境下乳鼠心肌細(xì)胞chemerin表達(dá)的變化
　　目的:觀察高糖和炎癥因子TNF-α對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞chemerin mRNA表達(dá)的影響方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后換為無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)

8、，然后分組后繼續(xù)培養(yǎng):
　　1.觀察葡萄糖干預(yù)心肌細(xì)胞后chemerin mRNA表達(dá)的變化:(1)不同濃度的葡萄糖干預(yù)24小時(shí):對(duì)照組(5.5mmol/L)組、10mmol/L組、20mmol/L組、30mmol/L、40mmol/L組和高滲組(5.5mmol/L葡萄糖+34.5mmol/L甘露醇)。應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)。(2)30mmol/L的葡萄糖干預(yù)不同時(shí)間:0

9、小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)。應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)。
　　2.觀察TNF-α干預(yù)心肌細(xì)胞后chemerin mRNA表達(dá)的變化:(1)不同濃度的TNF-α干預(yù)24小時(shí):空白對(duì)照組、5ng/ml組、10ng/ml組和20ng/ml組。應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)。(2)20ng/ml的TNF-α干預(yù)不同時(shí)

10、間:0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)。應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.高糖可誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)增加。(1)隨著葡萄糖干預(yù)濃度的增加，心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)隨之增加，在葡萄糖濃度30mmol/L組達(dá)到峰值，差異與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);40mmol/L組較30mmol/L組表達(dá)降

11、低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與對(duì)照組相比，高滲組chemerin mRNA的表達(dá)并沒有明顯的變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)隨著葡萄糖干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)水平隨之升高，在24小時(shí)達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);48小時(shí)組較24小時(shí)表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.TNF-α也可誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)增加。(1)隨

12、著TNF-α干預(yù)濃度的增加，心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)隨之增加，在TNF-α濃度20ng/ml組達(dá)到最高值。5ng/ml組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，10ng/ml組、20ng/ml組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(2)隨著TNF-α干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)水平隨之升高，在24小時(shí)達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;48小時(shí)組較24小時(shí)組表達(dá)略降低，

13、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:高糖環(huán)境中和炎癥狀態(tài)下乳鼠心肌細(xì)胞chemerin mRNA的表達(dá)均上調(diào)。
　　第三部分、Chemerin誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗
　　目的:探討chemerin是否破壞胰島素信號(hào)，引起心肌細(xì)胞的胰島素抵抗。
　　方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h后換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行分組。首先以不同濃度的chemerin（對(duì)

14、照組、10ng/ml組、100 ng/ml組）干預(yù)24小時(shí)，然后以10-7mol/l胰島素刺激30分鐘。應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞Akt、IRS-1和AMPKα的磷酸化水平，應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定心肌細(xì)胞的葡萄糖攝取率（glucose uptake）。
　　結(jié)果:無胰島素刺激組和胰島素刺激組，隨著chemerin濃度的升高，Akt的磷酸化水平均隨之降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);無胰島素刺激組和胰島素刺激組

15、，隨著chemerin濃度的升高，IRS-1的磷酸化水平均隨之升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　無胰島素刺激組和胰島素刺激組，隨著chemerin濃度的升高，葡萄糖攝取率與AMPKα(Thr172)的磷酸化水平也隨之降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:Chemerin誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。
　　第四部分、Chemerin誘導(dǎo)心肌胰島素抵抗的分子機(jī)制
　　目的:探討chemer

16、in誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗的分子機(jī)制方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h后換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行分組。
　　1.探討chemerin可激活哪些信號(hào)通路:首先以0ng/ml或者100 ng/mlchemerin干預(yù)心肌細(xì)胞24小時(shí)，然后以10-7mol/l胰島素刺激30分鐘。應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞p38 MAPK、ERK-1/2和JNK的總蛋白水平和磷酸化

17、水平。
　　2.ERK1/2信號(hào)通路在chemerin誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗中的作用:應(yīng)用ERK阻滯劑PD98059（50 umol/l）預(yù)干預(yù)15分鐘，之后Chemerin(100ng/ml)干預(yù)24小時(shí)，最后應(yīng)用胰島素(10-7mol/l)刺激30分鐘，具體分組如下:①空白對(duì)照組;②胰島素組;③Chemerin組;④Chemerin+胰島素組;⑤PD98059+chemerin組;⑥PD98059+chemerin+胰島素

18、組。應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞Akt和AMPKα的磷酸化水平;應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定心肌細(xì)胞的葡萄糖攝取率。
　　結(jié)果:
　　1.胰島素刺激后，chemerin可激活ERK1/2與p38MAPK信號(hào)通路:
　　無胰島素刺激組，chemerin干預(yù)后， p38 MAPK的磷酸化水平較對(duì)照組無明顯升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）;但胰島素刺激組，p38MAPK磷酸化水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

19、＜0.05）。無胰島素刺激組與胰島素刺激組，chemerin干預(yù)后，ERK-1/2的磷酸化水平均較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。無胰島素刺激組與胰島素刺激組，chemerin干預(yù)后，JNK的磷酸化水平均較對(duì)照組無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.ERK1/2阻滯劑可部分逆轉(zhuǎn)chemerin誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞胰島素抵抗:
　　胰島素刺激組，chemerin和PD98059干預(yù)后，Akt的磷酸化水