持續(xù)胰島素輸注對膿毒癥早期大鼠肝臟線粒體損傷的保護作用.pdf

1、目的:膿毒癥（sepsis）是兒科疾病的主要死亡原因之一，若不及時治療可引起多器官功能障礙綜合征（MODS）。線粒體是細胞能量生成的主要場所，膿毒癥早期即可發(fā)生線粒體損傷，早期線粒體損傷是膿毒癥發(fā)展為MODS的重要啟動環(huán)節(jié)。因而，積極尋求有效方法保護線粒體和改善其功能是減少膿毒癥嚴重并發(fā)癥發(fā)生率和病死率的重要途徑。近年來研究表明，胰島素（insulin）除了降血糖的作用外，還有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、防止內(nèi)皮細胞損傷、改善血脂

2、代謝作用、促進合成和抗細胞凋亡的等作用，這些作用的早期干預(yù)對防止膿毒癥進一步發(fā)展為MODS有著重要的意義。此外，肝臟是機體進行物質(zhì)和能量代謝的重要器官，并且在膿毒癥早期極易受損。本課題通過觀察持續(xù)胰島素輸注對膿毒癥早期大鼠肝臟功能及其線粒體膜電位、形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響和對血清TNF-α、IL-6、CRP水平及血糖水平、血脂代謝的影響，探討持續(xù)胰島素輸注對膿毒癥早期大鼠肝臟線粒體是否具有保護作用及其作用機制，為臨床上減少膿毒癥嚴重并

3、發(fā)癥的發(fā)生率和降低膿毒癥病死率提供新的方法和思路。 方法: 1．建立動物模型及分組:膿毒癥模型采用腹腔注射10mg/kg LPS建立。24只SD大鼠隨機分為3組（各組大鼠在實驗前1天行右頸外靜脈置管術(shù)）：正常對照組（n=8）：腹腔注射與靜脈泵注與其它兩組等容量的生理鹽水；LPS組（n=8）：腹腔注射LPS10mg/kg，同時持續(xù)泵注生理鹽水1ml/h；胰島素干預(yù)組（n=8）：腹腔注射LPS10mg/kg，同時持續(xù)泵注胰島

4、素生理鹽水溶液1ml/h，胰島素用量為0．25U/kg/h。 2．檢測指標及方法 （1）大鼠一般情況 ①觀察注射LPS前20min及注射后2h、6h、12h和24h的肛溫、心率和呼吸頻率。 ②運用快速血糖儀檢測上述各時點的血糖水平（BG）。 （2）大鼠炎癥反應(yīng)指標 ①運用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測注射LPS后2h、6h的大鼠血清TNF-α和IL-6的濃度和24h的大鼠

5、血清CRP的濃度。 （3）大鼠生化指標 ①肝功能指標：運用全自動生化分析儀檢測注射LPS后24h的大鼠血清ALT和AST水平。 ②脂代謝指標：運用全自動生化分析儀檢測注射LPS后24h的大鼠血清TG、HDL和LDL水平。 （4）大鼠肝臟粒體損傷相關(guān)指標 ①采用差速離心法提取大鼠肝臟線粒體，JC-1染料染色，流式細胞儀檢測線粒體腫脹程度和線粒體膜電位。 ②運用比色法檢測大鼠肝臟線粒體氧化應(yīng)激

6、相關(guān)指標（SOD、MDA）。 ③電鏡觀察大鼠肝臟線粒體損傷狀況，按照Flameng分級方法對線粒體進行半定量評分。 3．統(tǒng)計方法 獲得的數(shù)據(jù)SPSS13．0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果用均值±標準差（x±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析，在多樣本均數(shù)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時進行均數(shù)兩兩比較，方差齊性者采用LSD法分析組間差異，方差不齊者采用Games-Howell法分析組間差異；重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析；相關(guān)

7、分析采用Pearson進行檢驗；α值界定為0．05。 結(jié)果: 1．動物一般情況：LPS組和胰島素干預(yù)組均出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)癥狀體征。與正常對照組相比，LPS組各監(jiān)測時點血糖水平顯著升高；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組各監(jiān)測時點血糖水平顯著下降。 2．大鼠炎癥反應(yīng)指標 （1）各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平的比較:腹腔注射LPS后2h和6h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組大鼠血清TNF-α和IL-6

8、水平顯著升高；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組大鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著降低。 （2）各組大鼠血清C-反應(yīng)蛋白水平的比較:腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組大鼠血清CRP水平顯著升高；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組大鼠血清CRP無顯著改變。 3．大鼠生化指標 （1）各組大鼠血清AST和AST水平的比較:腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組大鼠血清ALT

9、和AST水平顯著升高；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組大鼠血清ALT和AST水平顯著下降。 （2）各組大鼠血清TG、HDL和LDL水平的比較:腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組大鼠血清TG、HDL和LDL水平均無顯著改變；與LPS組相比，胰島素干預(yù)組大鼠血清TG和HDL水平改變不顯著，而LDL水平則顯著上升。 4．大鼠肝臟線粒體指標 （1）各組大鼠肝臟線粒體腫脹程度和膜電位的比較:腹腔注

10、射LPS后24h，各組大鼠間肝臟線粒體腫脹程度的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組肝臟線粒體膜電位顯著下降；而胰島素干預(yù)組肝臟線粒體膜電位與LPS組相比則顯著上升。 （2）各組大鼠肝臟線粒體SOD、MDA水平的比較:腹腔注射LPS后24h，與正常對照組相比，LPS組和胰島素干預(yù)組肝臟線粒體SOD水平顯著升高；而胰島素干預(yù)組與內(nèi)毒素血癥組相比，肝臟線粒體SOD水平則顯著降低；各組

11、大鼠肝臟線粒體MDA水平則無顯著差異。 （3）各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察及半定量分析:腹腔注射LPS后24h，各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察改變不明顯，半定量分析無顯著差異。 5．大鼠肝臟線粒體膜電位與其他指標的相關(guān)性分析:大鼠肝臟線粒體膜電位與血清ALT和AST水平呈負相關(guān)。大鼠肝臟線粒體膜電位與血清TG、HDL和LDL水平均無顯著的相關(guān)關(guān)系。大鼠肝臟線粒體膜電位與腹腔注射LPS后6h大鼠血清TNF-α、IL-6水平呈負相

12、關(guān)。大鼠肝臟線粒體膜電位與腹腔注射LPS后6h和12h大鼠血糖水平呈負相關(guān)。 結(jié)論: 1．膿毒癥早期存在肝臟功能損傷，這種功能性損傷與線粒體功能損傷相關(guān)。 2．膿毒癥早期肝臟線粒體功能已經(jīng)明顯損傷，而其結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生明顯改變；膿毒癥早期肝臟線粒體損傷具有可逆性，膿毒癥時肝臟線粒體的保護關(guān)鍵在于早期治療。 3．持續(xù)胰島素輸注對膿毒癥早期大鼠肝臟線粒體有明顯的保護作用，此保護作用與其降低過高的血糖水平、減輕氧化