瓜氨酸對膿毒癥早期大鼠肝損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、第一部分瓜氨酸對膿毒癥大鼠肝損傷及Cit-NO循環(huán)的影響
　　背景與目的：臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時血漿及肌肉中的精氨酸（Arg）水平明顯下降，然而對膿毒癥患者直接補充外源性精氨酸并不能改善膿毒癥的病情發(fā)展。瓜氨酸（Cit）可以通過“瓜氨酸—一氧化氮循環(huán)”（Cit-NO cycle）參與精氨酸的體內(nèi)代謝。并且肝臟是參與Cit-NO循環(huán)的重要器官之一，同時也是膿毒癥發(fā)生發(fā)展中最容易受到損傷的器官之一。因此，本研究探討補充外源性瓜氨酸對膿

2、毒癥大鼠肝損傷以及Cit-NO循環(huán)的影響。方法：本研究采用最經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）膿毒癥大鼠模型，將大鼠分為正常組（Normal group），假手術(shù)組（sham group），瓜氨酸組（Cit group），生理鹽水組（NS group），CLP模型組（CLP group）以及CLP模型加瓜氨酸組（CLP+Cit group）。再根據(jù)CLP造模后大鼠被處死的時間點，CLP組和CLP+Cit組又各自分出6h，12h，24h，48h

3、四個時間點亞組。Cit組和CLP+Cit組大鼠術(shù)前給予瓜氨酸連續(xù)灌胃給藥7天，劑量為200 mg/d。
　　術(shù)后每6小時觀察各組大鼠一般狀況及生存情況，在預(yù)定時間點處死各組大鼠，收集大鼠血液及肝臟組織樣本。取大鼠血液使用生化檢測儀檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平。取肝臟組織做HE染色觀察病理變化情況，利用檢測試劑盒分別測量大鼠肝臟組織超氧化物歧化酶（SOD）的活力、丙二醛（MDA）的含量、N

4、O的含量以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的活力。運用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測大鼠血漿中Cit和Arg含量。所有相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行，設(shè)定P<0.05為存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：Sham group，Cit group和NS group存活率均為100％（8/8）。CLP group術(shù)后6h，12h，24h，48h四個時間點亞組相對應(yīng)的存活率分別為：75%（9/12），5

5、0%（8/16），33.33%（8/24）和6.25%（2/32）。CLP+Cit group術(shù)后6h，12h，24h，48h四個時間點亞組相對應(yīng)的存活率分別為：83.33%（10/12），68.75%（11/16），66.67%（16/24）和25%（8/32）。CLP+Cit24h和48h亞組大鼠的生存率均顯著高于相對應(yīng)的CLP24h和48h亞組大鼠（both P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示所有CLP組和CLP+Cit組大鼠肝臟均

6、出現(xiàn)不同程度的肝損傷相關(guān)病理改變。
　　此外，實驗結(jié)果顯示CLP+Cit12h和24h亞組大鼠血清AST水平顯著低于CLP12h和24h亞組（both P<0.05）。在CLP術(shù)后6h，12h，24h三個時間點，CLP+Cit各組大鼠肝臟SOD活力值都顯著高于CLP各組（all P<0.05）。然而，CLP+Cit各組大鼠肝臟MDA水平都低于CLP各組，其中CLP+Cit12h和24h亞組大鼠肝臟MDA水平顯著低于CLP12h和2

7、4h亞組。
　　另外，在CLP術(shù)后6h，12h，24h三個時間點，CLP各組大鼠肝臟NO水平都顯著高于CLP+Cit各組（all P<0.05）。同時，iNOS活力在CLP+Cit各組中都低于CLP各組，但比較不存在統(tǒng)計學(xué)差異。在術(shù)后24h內(nèi)，CLP組大鼠血漿Arg水平隨著時間變化呈下降趨勢，并且CLP24h亞組大鼠血漿Arg含量顯著低于正常組。此外，CLP+Cit組大鼠血漿Arg濃度明顯高于CLP組。CLP術(shù)后24h內(nèi)，CLP+

8、Cit組大鼠血漿Arg水平改變不顯著，CLP+Cit24h亞組大鼠血漿Arg含量接近基線水平（Cit group）。
　　結(jié)論：補充外源性瓜氨酸可以改善膿毒癥大鼠的生存情況，提高存活率。補充外源性瓜氨酸可以使得膿毒癥大鼠肝組織SOD活力升高，提高膿毒癥大鼠肝臟抗氧化的能力，對肝臟具有保護作用。補充外源性瓜氨酸可以降低膿毒癥早期大鼠肝臟中MDA水平，減輕肝臟受損傷程度。外源性瓜氨酸可以減少膿毒癥時NO的生成，提高血漿Arg含量并且使

9、之維持在基線水平。
　　第二部分瓜氨酸對膿毒癥早期細胞因子表達的影響
　　背景與目的：細胞因子在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色。膿毒癥早期，機體處于促炎階段，此時體內(nèi)產(chǎn)生大量的促炎細胞因子，主要包括IL-1、IL-6、TNF-α等。這些促炎細胞因子的釋放，激活機體先天性或者適應(yīng)性免疫應(yīng)答，進一步誘導(dǎo)其它細胞因子或炎癥介質(zhì)釋放，引起“細胞因子風暴”，是造成肝損傷的重要因素。前期研究發(fā)現(xiàn)外源性瓜氨酸可以降低膿毒癥大鼠促炎

10、因子IL-6的表達，被視為一種安全的免疫調(diào)節(jié)途徑。因此，本部分研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步全面探討外源性瓜氨酸對膿毒癥早期主要細胞因子表達的影響。
　　方法：利用CLP膿毒癥大鼠模型，將大鼠分為正常組（Normal group），瓜氨酸組（Cit group），CLP模型組（CLP group）以及CLP模型加瓜氨酸組（CLP+Cit group）。根據(jù)造模后大鼠被處死的時間點，CLP組和CLP+Cit組又各自分出6h，12h，

11、24h三個時間點亞組。
　　利用Luminex懸浮液態(tài)芯片技術(shù)對各組大鼠血清中細胞因子的濃度進行檢測，總共包括27種細胞因子和趨化因子：EGF，Eotaxin，F(xiàn)ractalkine，G-CSF，GM-CSF，GRO/KC/CINC-1，IFN-γ，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12(p70)，IL-13，IL-17A，IL-18，IP-10，Leptin，LIX，MCP-1，M

12、IP-1α，MIP-2，RANTES，TNF-α和VEGF。
　　結(jié)果：懸浮液態(tài)芯片檢測細胞因子得到的標準曲線以及質(zhì)控參數(shù)結(jié)果均滿意。細胞因子濃度結(jié)果顯示，CLP6h亞組大鼠血清中所有檢測的27種細胞因子濃度都高于正常組，其中21種細胞因子的濃度比較存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。其余6種細胞因子IL-13，F(xiàn)ractalkine，LIX，IL-18，VEGF，IL-12(p70)在CLP6h亞組中的濃度同樣高于正常組，但不存在統(tǒng)

13、計學(xué)差異。
　　在CLP造模后24h內(nèi)，總共檢測的27種細胞因子中，20種細胞因子的血清濃度水平達到峰值的時間點在CLP+Cit group中晚于CLP group，包括EGF，Eotaxin，G-CSF，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12(p70)，IFN-γ，IL-17，Leptin，MCP-1，MIP-1α，MIP-2，TNF-α，VEGF，IL-13和Fractalkine。只有2種

14、細胞因子GM-CSF和IP-10的濃度峰值在CLP+Cit group中出現(xiàn)得早于CLP group。
　　此外在CLP術(shù)后6h時，促炎細胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6在CLP6h亞組大鼠血清中的濃度明顯高于CLP+Cit6h亞組（all P<0.05）。而在造模后24h時間點上，主要的抗炎因子IL-4和IL-10在CLP+Cit24h亞組大鼠血清中的濃度比CLP24h亞組高出5倍左右，其中血清IL-4的比較存在統(tǒng)計學(xué)差異

15、
　　結(jié)論：芯片結(jié)果表明我們實驗中CLP膿毒癥大鼠模型建立效果滿意。補充外源性瓜氨酸可以延緩膿毒癥早期體內(nèi)細胞因子和趨化因子的釋放。補充外源性瓜氨酸使得膿毒癥早期機體的“促炎狀態(tài)”得到緩解，減少促炎細胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6的大量釋放。外源性瓜氨酸使得抗炎細胞因子IL-4和IL-10的釋放延遲。
　　第三部分瓜氨酸對膿毒癥大鼠STAT1/STAT3信號通路的影響
　　背景與目的：JAK/STAT信號通路是

16、多種炎癥細胞因子的共同信號通路，在膿毒癥中發(fā)揮著舉足輕重的作用。其中STAT1和STAT3在膿毒癥中相關(guān)作用的研究報道尤為突出，被認為是與膿毒癥關(guān)系最為密切的STAT家族成員，參與許多炎癥因子的信號傳導(dǎo)過程。本部分研究在前一部分研究的基礎(chǔ)上，探討補充外源性瓜氨酸對膿毒癥大鼠STAT1/STAT3信號通路的影響。
　　方法：利用CLP膿毒癥大鼠模型，將大鼠分為CLP模型組（CLP group）以及CLP模型加瓜氨酸組（CLP+Cit

17、 group）。根據(jù)造模后大鼠被處死的時間點，CLP group和CLP+Cit group又各自分出6h，12h，24h三個時間點亞組。
　　利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測CLP group和CLP+Cit group大鼠造模術(shù)后6h，12h，24h三個時間點肝臟組織中STAT1和STAT3的mRNA表達水平。利用免疫印跡方法檢測CLP group和CLP+Cit group大鼠肝臟組織中STAT1和STAT3的蛋白表達水平以及

18、磷酸化水平。結(jié)果：在術(shù)后6h，12h，24h三個時間點，STAT1和STAT3 mRNA相對表達量在CLP group和CLP+Cit group之間都不存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異。同樣在這三個時間點上，CLP group和CLP+Cit group大鼠肝臟組織中STAT1和STAT3蛋白表達水平也不存在統(tǒng)計學(xué)差異。但是，CLP+Cit6h和12h亞組大鼠肝臟組織STAT1和STAT3的磷酸化水平則明顯低于CLP6h和12h亞組。
　　結(jié)