滸苔多糖對膿毒癥腦病大鼠的腦保護作用及其機制研究.pdf

1、膿毒癥相關性腦?。⊿epsis-associated encephalopathy，SAE）是膿毒癥患者常見的彌漫性腦功能障礙，與膿毒癥患者的死亡率密切相關。SAE引起的認知功能障礙是主要的神經(jīng)損傷之一，與癥狀的嚴重程度并無相關性，但對患者遠期的生活質(zhì)量影響較大。因此，迫切需要探索SAE的發(fā)病機制，并開發(fā)相應的藥物以減輕SAE的嚴重程度，最終降低SAE的死亡率。
　　氧化應激與SAE的發(fā)病密切相關。過多的氧自由基和/或抗氧化劑缺乏

2、對大腦的不同區(qū)域造成明顯的形態(tài)和認知功能障礙，而通過藥物抑制氧化應激確實可以逆轉膿毒癥相關性腦病大鼠出現(xiàn)的認知能力下降。此外，高水平的誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）也可以促進SAE的發(fā)生。
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，廣泛分布在大腦中。BDNF在神經(jīng)元存活和突觸傳遞中

3、發(fā)揮重要作用。在SAE大鼠模型中，丙戊酸通過激活BDNF可以顯著改善SAE大鼠認知功能障礙，提示BDNF可以作為緩解SAE的有用治療靶標。
　　滸苔多糖（Enteromorpha clathrate polysaccharides，ECP）是從滸苔中純化的多糖成分，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用。滸苔多糖可顯著降低膿毒癥大鼠中白細胞和中性粒細胞的數(shù)量，從而減輕炎癥反應；提高淋巴細胞數(shù)和CD4+T淋巴細胞數(shù)，從而改善免疫功能。然而，滸

4、苔多糖是否能夠改善膿毒癥大鼠的認知表現(xiàn)仍然難以捉摸。因此，本研究旨在探討滸苔多糖對SAE的腦保護作用，并找出潛在的機制。
　　目的：本研究旨在觀察滸苔多糖腹腔注射對膿毒癥大鼠認知功能的影響，并探索其腦保護作用的機制，為臨床的應用提供一定理論依據(jù)。
　　方法：
　　（1）分組及建立模型
　　將SD大鼠隨機分為對照組（CON組）、SAE組、SAE+滸苔多糖組（SAE+ECP組），每組20只，SAE+滸苔多糖組腹腔內(nèi)注

5、射100 mg/kg滸苔多糖，CON組和SAE組于相同時間點腹腔內(nèi)注射生理鹽水。
　　選用盲腸結扎穿孔法（CLP）建立SAE模型。取SD大鼠，用2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，腹部剃毛并用碘伏消毒，沿腹中線剪開2 cm腹部切口，暴露盲腸，在回盲瓣遠端結扎盲腸，然后用針刺穿刺盲腸2次，輕輕擠壓盲腸，使少量的腸內(nèi)容物滲出，然后將盲腸返回到腹腔，關閉腹腔。假手術組大鼠行剖腹，并將盲腸外置1分鐘，不予盲腸穿刺或結扎

6、，然后將盲腸放回腹腔并關腹。每只手術操作的大鼠術后每6小時給予皮下注射生理鹽水（30 mL/kg）及頭孢曲松（30 mg/kg）。制作膿毒癥大鼠模型24小時后評估大鼠神經(jīng)行為學，計算神經(jīng)反射評分≤6分的為SAE模型。不符合SAE模型標準的，則放棄該例大鼠并重新制作大鼠膿毒癥模型補充。
　?。?）大鼠一般狀況
　　觀察各組大鼠的精神狀況，有無立毛、寒戰(zhàn)、腹瀉和出血傾向，測量術前、術后6 h、12 h和24 h大鼠的體溫、心率和

7、平均動脈壓等基本生命體征，并測量實驗大鼠7d的體重變化。
　?。?）行為學實驗
　　采用曠場實驗、Morris水迷宮實驗及Y-迷宮測試評估各組大鼠的一般活動能力和學習記憶能力。
　　（4）氧化應激反應指標
　　采用硝酸還原酶法測定各組大鼠海馬 NO含量；采用 L-精氨酸氧化法測定各組大鼠海馬iNOS含量；采用硫代巴比妥酸法測定各組大鼠海馬丙二醛（MDA）活性；采用黃嘌呤氧化酶法測定各組大鼠海馬超氧化物歧化酶（SO

8、D）活性；此外，還檢測了大鼠海馬組織過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性。
　　（5）BDNF/p-TrkB的表達
　　處死大鼠，取大鼠海馬組織，用Western blot法分別檢測BDNF和p-TrkB的表達。
　　結果：
　?。?）動物一般狀況
　　對照組大鼠一般狀況良好，心率、呼吸頻率和體溫等基本生命體征平穩(wěn)；SAE組大鼠表現(xiàn)出蜷縮少動、豎毛，個別大鼠出現(xiàn)偏癱、癲癇發(fā)作；而且

9、平均動脈壓和體重明顯下降，心率顯著升高。
　　（2）行為學試驗
　　曠場實驗顯示，各組大鼠的探索路程差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明假手術、SAE或ECP不影響大鼠的自主活動。在Morris水迷宮實驗中，CON組和SAE+ECP組大鼠到達目標平臺的時間明顯少于SAE組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；SAE組大鼠的游泳距離較CON組和SAE+ECP組存在顯著差異（P＜0.01），但游泳速度無統(tǒng)計學差異（P＞0.05

10、）；CON組和SAE+ECP組大鼠跨越平臺次數(shù)、原平臺所在象限游泳時間比例均明顯高于SAE組，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在Y-迷宮測試中，與CON組和SAE+ECP組相比，SAE組大鼠達標所需的訓練次數(shù)較多，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這些結果均提示SAE導致明顯的學習記憶損害，而滸苔多糖治療能明顯改善SAE大鼠的學習記憶功能。
　?。?）各組大鼠海馬氧化應激指標
　　各組大鼠的血氨濃度之間無統(tǒng)計學差異

11、（P＞0.05），說明滸苔多糖在此實驗中沒有引起血清氨濃度改變從而影響認知功能；
　　NO含量變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組NO含量顯著升高；與SAE組相比較，SAE+ECP組NO含量顯著降低（P＜0.01）；
　　iNOS活性變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組iNOS活力顯著升高（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組iNOS活性顯著降低（P＜0.01）；
　　MDA含量變

12、化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組MDA含量顯著降低（P＜0.01）；
　　CAT活性變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組CAT活性顯著降低（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組CAT活性顯著升高（P＜0.01）；
　　SOD活性變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組SOD活性顯著降低（P＜0.01）；與SA

13、E組相比較，SAE+ECP組SOD活性顯著升高（P＜0.01）；
　　GSH-Px活性變化：與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組GSH-Px活性顯著降低（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組GSH-Px活性顯著升高（P＜0.01）；
　　這些結果均表明，SAE組大鼠海馬區(qū)存在明顯的氧化應激損傷，滸苔多糖治療后這些損傷可得到明顯改善。
　?。?）各組大鼠海馬組織中BDNF和p-TrkB表達水平

14、　　與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組BDNF表達水平顯著降低（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組BDNF表達水平顯著升高（P＜0.01）；
　　與CON組相比，SAE組和SAE+ECP組p-TrkB表達水平顯著降低（P＜0.01）；與SAE組相比較，SAE+ECP組p-TrkB表達水平顯著升高（P＜0.01）；
　　結果表明，SAE引起大鼠海馬組織中BDNF和p-TrkB蛋白表達下調(diào)，滸苔多糖處理可

15、促進BDNF和p-TrkB的表達。
　　結論：
　?。?）CLP組大鼠完全模擬了膿毒癥典型臨床表現(xiàn)，應用神經(jīng)行為學檢查提示大鼠膿毒癥相關性腦病（SAE）模型制作成功，為后續(xù)SAE機制研究做好基礎。滸苔多糖能保護SAE大鼠認知記憶功能。
　?。?）膿毒癥可引起大鼠海馬組織氧化應激損傷，而滸苔多糖的使用可顯著降低氧化應激的水平，表明滸苔多糖可能通過抑制氧化應激反應發(fā)揮其功效。
　?。?）膿毒癥相關性腦病可導致SAE大