Notch信號(hào)通路介導(dǎo)膿毒癥腦病的作用及機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥腦病又稱膿毒癥相關(guān)性腦病(Sepsis-associated encephalopathy，SAE)是膿毒癥引起的彌漫性腦功能障礙，其發(fā)病率為8％-70％。臨床研究發(fā)現(xiàn)，SAE是ICU中最常見的腦病之一，并發(fā)SAE可導(dǎo)致膿毒癥患者的死亡率明顯增高。SAE病理生理機(jī)制較復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是大量的研究結(jié)果表明神經(jīng)元凋亡是SAE發(fā)生及發(fā)展過程的重要表現(xiàn)之一。研究證實(shí)，在膿毒癥大鼠模型中，SAE可導(dǎo)致大鼠長(zhǎng)期的記憶損傷。其中，與

2、空間記憶密切相關(guān)的海馬等腦區(qū)的損傷程度尤為明顯。
　　本研究以Notch信號(hào)通路為主要研究對(duì)象，探討SAE發(fā)病機(jī)制。Notch信號(hào)通路是調(diào)控神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。最新研究表明，γ-分泌酶復(fù)合體和Notch1參與了一些神經(jīng)變性疾病的發(fā)病過程，如阿爾茨海默病、缺血性腦卒中等。同時(shí)，Notch信號(hào)通路特異性抑制劑DAPT可有效抑制凋亡和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的腦缺血性損傷，其作用機(jī)制與Notch信號(hào)通路在PARP-1激活凋亡過程中起到調(diào)控

3、作用有關(guān)。新近研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1激活后通過自身分裂和核內(nèi)凋亡相關(guān)因子，活化caspase通路，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡。
　　本研究以盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)建立大鼠的膿毒癥模型，集中開展了Notch信號(hào)通路在SAE中的作用及其機(jī)制研究。研究表明，CLP后24小時(shí)，Notch受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(NICD)表達(dá)顯著增加，大鼠海馬組織炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元死亡等也明顯增加。DAPT能明顯減少海馬組織神經(jīng)元凋亡和死亡，以及TNF-α、

4、IL-1b、IL-6、PARP-1和Caspase-1的表達(dá)。同時(shí)，CLP引起NF-κB轉(zhuǎn)核作用也可被DAPT明顯抑制。
　　綜上所述，Notch信號(hào)通路參與了膿毒癥導(dǎo)致的腦損傷，其作用機(jī)制與調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)核有關(guān)。研究結(jié)果可為SAE的治療提供新的策略和藥物靶標(biāo)。
　　第一部分 Notch信號(hào)通路在膿毒癥腦病中的作用
　　目的:膿毒癥相關(guān)性腦病(SAE)病理生理機(jī)制尚不明確，缺乏客觀的診斷指標(biāo)及有效的治療和預(yù)防手段。研

5、究發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶復(fù)合體和Notch1參與了一些神經(jīng)變性疾病的發(fā)病過程，γ-分泌酶抑制劑DAPT能抑制凋亡和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的腦缺血性損傷。本部分選用盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)建立膿毒癥模型，觀察Notch信號(hào)通路在膿毒癥腦病中的作用及DAPT對(duì)膿毒癥腦病的保護(hù)作用。
　　方法:取SD大鼠，建立CLP模型，戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部剃毛并用碘伏消毒，鋪巾，沿腹中線剪開2cm腹部切口，暴露盲腸，在回盲瓣遠(yuǎn)端結(jié)扎盲腸，然后用

6、18號(hào)針刺穿刺盲腸2次，輕輕擠壓盲腸，使少量的腸內(nèi)容物滲出，然后將盲腸返回到腹腔，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組(sham)大鼠予剖腹，并將盲腸外置1分鐘，不予盲腸穿刺或結(jié)扎，然后將盲腸回納至腹腔并關(guān)腹。每只手術(shù)操作的大鼠術(shù)后每6小時(shí)給予皮下注射生理鹽水（3ml/100g）及頭孢曲松（30mg/kg）。實(shí)驗(yàn)于麻醉后直視下行股動(dòng)脈切開置入24G輸液管以測(cè)定血壓、心率。記錄術(shù)前、術(shù)后6h、12h和24h血壓、心率和肛溫，并在以上時(shí)間點(diǎn)經(jīng)股動(dòng)脈采血1ml

7、測(cè)血乳酸水平（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，n=3）。59只大鼠隨機(jī)分為四組:(a)假手術(shù)+生理鹽水組(10ml/kg);(b)假手術(shù)+DAPT組(10μmol/kg);(c)CLP+生理鹽水組(10ml/kg);(d)CLP+DAPT組（10μmol/kg）。每組分為2個(gè)亞組，第一亞組，24小時(shí)處死大鼠，斷頭取血，分離海馬組織，-80℃保存，行NICD的Western-Blot蛋白檢測(cè)。第二亞組，術(shù)后每6小時(shí)予皮下注射生理鹽水(3ml/100g)及頭孢

8、曲松(30mg/kg)，并允許自由進(jìn)食及飲水。術(shù)后第7天存活大鼠檢測(cè)行為學(xué)改變（新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)）。
　　結(jié)果:CLP組大鼠出現(xiàn)蜷縮少動(dòng)、豎毛，個(gè)別大鼠出現(xiàn)偏癱、癲癇發(fā)作表現(xiàn);并出現(xiàn)平均動(dòng)脈壓明顯下降，心率明顯升高，血乳酸水平增高;體重明顯下降;第3天為56.3％，第4-7天為37.5％; CLP組大鼠24h神經(jīng)反射評(píng)分明顯下降，并在第4天、第7天已逐漸恢復(fù);新物體認(rèn)知試驗(yàn)提示CLP大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損。在CLP后24h，NICD表

9、達(dá)顯著增加。γ-分泌酶抑制劑DAPT能降低CLP后NICD的表達(dá)，緩解認(rèn)知功能損傷。
　　結(jié)論: CLP組大鼠完全模擬了膿毒癥典型臨床表現(xiàn)，神經(jīng)反射評(píng)分及行為學(xué)檢查提示大鼠膿毒癥相關(guān)性腦病(SAE)模型制作成功;首次發(fā)現(xiàn)在CLP后24h，NICD表達(dá)顯著增加，說明Notch信號(hào)通路可能參與了膿毒癥導(dǎo)致的腦損傷;同時(shí)應(yīng)用DAPT抑制Notch信號(hào)通路對(duì)膿毒癥大鼠的記憶損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分 Notch信號(hào)通路參與膿

10、毒癥腦病的機(jī)制研究
　　目的:在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們通過構(gòu)建大鼠CLP膿毒癥模型，主要探討Notch信號(hào)通路參與膿毒癥腦病的可能發(fā)病機(jī)制，以及γ-分泌酶抑制劑通過阻斷Notch1信號(hào)通路對(duì)膿毒癥腦病大鼠的干預(yù)作用。
　　方法:隨機(jī)將59只SD大鼠分為4組，分別為假手術(shù)組(Sham)、假手術(shù)+DAPT組(Sham+DAPT)、CLP組(CLP)、CLP+DAPT組，在CLP或假手術(shù)后24h，將大鼠處死，取出海馬組織用于Weste

11、n blot法檢測(cè)PARP-1、Caspase-1; ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1b、IL-6水平。TUNEL法觀察神經(jīng)元凋亡，HE染色法觀察神經(jīng)元死亡。
　　結(jié)果:我們研究表明在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，比較于假手術(shù)組和假手術(shù)+DAPT組，在CLP組TNF-α、IL-1b、IL-6水平顯著增高，盡管在CLP+DAPT組增高受到抑制。通過HE染色和TUNEL染色法檢測(cè)，評(píng)估海馬組織神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡。在假手術(shù)組和假手術(shù)+DAPT組中幾乎

12、不能找到HE陽性的細(xì)胞。在CLP手術(shù)后，海馬組織CA1區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞死亡明顯增加。然而，與CLP組相比，HE染色陽性細(xì)胞在CLP+DAPT組明顯減少。此外，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，在CLP組中TUNEL陽性細(xì)胞明顯增加，但是在假手術(shù)組幾乎不能檢測(cè)到TUNEL陽性細(xì)胞。而神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目在CLP+DAPT組明顯多于假手術(shù)組+DAPT組，與CLP組比較，前兩組凋亡數(shù)目明顯減少。
　　在膿毒癥大鼠中，海馬組織炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡

13、、神經(jīng)元死亡明顯增加。DAPT能明顯減少海馬組織神經(jīng)元凋亡和死亡，及其TNF-α、IL-1b、IL-6、PARP-1和Caspase-1的表達(dá)。
　　結(jié)論:證實(shí)了Notch信號(hào)通路通過激活PARP-1降解，導(dǎo)致caspase依賴性神經(jīng)元凋亡，γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制海馬神經(jīng)元PARP-1降解，抑制caspase依賴性神經(jīng)元凋亡。DAPT通過抑制CLP膿毒癥大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)改善膿毒癥腦病。
　　第三部分 N

14、otch信號(hào)通路調(diào)控膿毒癥腦病的分子機(jī)制研究:調(diào)控NF-κB激活
　　目的:NF-κB是在核內(nèi)參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，亦廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡。研究顯示，NF-κB信號(hào)途徑在膿毒癥神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中也扮有重要角色。本實(shí)驗(yàn)部分采用CLP模型，研究膿毒癥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響，并通過Notch特異性抑制劑DAPT干預(yù)，觀察其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，由此深入研究Notch對(duì)膿毒癥腦病NF-

15、κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　方法:取SD大鼠，隨機(jī)分為四組(n=6)，分別為假手術(shù)組（Sham）、假手術(shù)+ DAPT組(Sham+DAPT)、CLP組(CLP)、CLP+DAPT組。手術(shù)操作前30分鐘腹腔注射DAPT（10μmol/kg）或生理鹽水(10mL/kg)。術(shù)后每6小時(shí)皮下注射生理鹽水(3ml/100g)及頭孢曲松(30mg/kg)復(fù)蘇，24小時(shí)處死大鼠，取大鼠海馬組織，液氮保存待測(cè)。用western blot和EMU

16、SA分組檢測(cè)NF-κ蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在Sham組動(dòng)物中，核因子NF-κB在胞漿中表達(dá)，CLP使得NF-κB胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。與Sham組相比，CLP組胞核內(nèi)NF-κB蛋白含量明顯升高，以p65最為顯著。與Sham及Sham+DAPT組相比，CLP組胞核內(nèi)NF-κB蛋白含量明顯升高，但DAPT處理降低胞核內(nèi)p65、 p50及RelB蛋白表達(dá)水平。與Sham組相比，CLP組磷酸化IKK-β表達(dá)明顯升高，但DAPT處理可抑制C

17、LP時(shí)磷酸化IKK-β表達(dá)。同樣，DAPT處理可抑制p65磷酸化，其可能與IKK-β活性降低有關(guān)，相應(yīng)的必然會(huì)導(dǎo)致p65 DNA結(jié)合活性降低。
　　結(jié)論:本研究中我們證實(shí)CLP導(dǎo)致的膿毒癥引起NF-κB由海馬神經(jīng)細(xì)胞胞漿向胞核內(nèi)遷移，應(yīng)用Notch信號(hào)通路特異性抑制劑DAPT抑制Notch靶基因表達(dá)，抑制NF-κB向胞核內(nèi)遷移及其DNA結(jié)合活性。結(jié)合前文，NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄激活引起膿毒癥海馬神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，可能是導(dǎo)致