Notch信號(hào)通路對(duì)心肌梗死合并糖尿病大鼠的心肌保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、心肌梗死是冠心病中的急危重癥，冠狀動(dòng)脈內(nèi)粥樣斑塊通常不穩(wěn)定極易破潰，從而引起出血，并且形成血栓，進(jìn)一步管腔閉塞。通?；加行募」Ｋ赖幕颊哐懿∽?cè)街兀渌劳雎试礁?。糖尿病是?dǎo)致冠心病的一個(gè)獨(dú)立且重要的危險(xiǎn)因素。糖尿病患者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)更高，冠心病合并糖尿病常為多支冠狀動(dòng)脈血管受累，病變彌漫且廣泛，冠狀動(dòng)脈內(nèi)更易形成斑塊和血栓。防治冠心病合并糖尿病現(xiàn)已成為全世界醫(yī)學(xué)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的巨大挑戰(zhàn)課題之一。
　　目的：
　　Notch信號(hào)通

2、路參與細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡、粘附等過程，與心血管疾病密切相關(guān)，其通過提高心肌細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡、防止心室重構(gòu)以及抑制心肌纖維化，從而發(fā)揮其對(duì)心臟的保護(hù)作用。在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死和心肌肥厚、心力衰竭模型中發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路的活性增強(qiáng)。但是以往研究均在非糖尿病模型中進(jìn)行，關(guān)于Notch信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥方面的研究，只局限于糖尿病腎病。目前國(guó)內(nèi)外還沒有關(guān)于Notch信號(hào)通路在心肌梗死合并糖尿病動(dòng)物模型中表達(dá)的相關(guān)研究報(bào)道

3、。因此本實(shí)驗(yàn)建立心肌梗死合并糖尿病大鼠模型，檢測(cè)Notch信號(hào)通路中Notch受體(Notch1、Notch4)、配體(Jagged1、Dll1)及Notch共激活子(Mastermind-like protein1、p300)的表達(dá)水平，并且進(jìn)一步通過體外心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)應(yīng)用激動(dòng)劑激活Notch信號(hào)通路從而進(jìn)一步證明該信號(hào)通路具有提高心肌梗死合并糖尿病大鼠心肌細(xì)胞活力、抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌的作用，為臨床上心肌梗死合并糖尿病的患者找到

4、新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分:Notch1、Notch4/Jagged1、Dll1/Mastermind-like protein1、p300在心肌梗死合并糖尿病大鼠心肌中的表達(dá)水平及其保護(hù)作用研究
　　本研究采用SD大鼠進(jìn)行如下在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立:選取6-8周齡健康雄性SD大鼠，體重200-250克。
　　糖尿病組(DM)、糖尿病假手術(shù)組（DM-sh

5、am，只進(jìn)行開胸手術(shù)及穿線，但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈）、心肌梗死合并糖尿病組(DM-MI)中的糖尿病大鼠為一次性腹腔注射STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠動(dòng)物模型（血糖大于396mmol/L作為建模成功）。對(duì)照組（Control）和心肌梗死組(MI)不做處理，心肌梗死組(MI)和心肌梗死合并糖尿病組(DM-MI)大鼠通過開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支25分鐘，再灌注2小時(shí)建立大鼠缺血-再灌注心肌梗死模型。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組:將SD大鼠隨機(jī)分為以下5組，每組6

6、只。
　　(1)對(duì)照組(Control):正常SD大鼠
　　(2)糖尿病組(DM): SD糖尿病大鼠（購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）
　　(3)糖尿病假手術(shù)組(DM-sham): SD糖尿病大鼠+缺血—再灌注假手術(shù)
　　(4)心肌梗死組(MI): SD大鼠+缺血—再灌注手術(shù)
　　(5)心肌梗死合并糖尿病組(DM-MI): SD糖尿病大鼠+缺血—再灌注手術(shù)
　　3、心肌梗死面積的測(cè)定:采用TTC染色

7、方法。
　　4、各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中磷酸肌酸激酶同功酶(CK-MB)和肌鈣蛋白的測(cè)定:應(yīng)用ELISA方法。
　　5、各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌纖維化程度的評(píng)價(jià):應(yīng)用Masson染色方法觀察各組大鼠的心臟病理結(jié)果。
　　6、各實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟心肌細(xì)胞凋亡率的檢測(cè):采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記染色法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPnick end labeling,TUN

8、EL)。
　　7、各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300 mRNA的表達(dá)水平的檢測(cè):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)方法。
　　8、各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300蛋白的表達(dá)水平的檢測(cè):采用Western blot方法

9、。
　　第二部分:激活Notch信號(hào)通路對(duì)缺氧合并高糖心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　本研究在體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞中進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
　　1、實(shí)驗(yàn)分組:
　　(1) H9C2:置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞;
　　(2)缺氧組:置于95％N2、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液正常;
　　(3)高糖組:培養(yǎng)液中加入33mmol/L的葡萄糖置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培

10、養(yǎng)72h;
　　(4)缺氧+高糖組:培養(yǎng)液中加入33mmol/L的葡萄糖置于95％N2、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);
　　(5)缺氧+Jagged-1組:將缺氧H9C2細(xì)胞在加入5μg/mL Jagged-1的培養(yǎng)液中培養(yǎng);
　　(6)缺氧+高糖+Jagged-1組:同時(shí)進(jìn)行缺氧及33mmol/L的葡萄糖處理，細(xì)胞在加入5μg/mL Jagged-1的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　2、各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞活力的檢測(cè):采用MTT比

11、色法，觀察心肌細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖的情況。
　　3、各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè):采用流式細(xì)胞技術(shù)。
　　4、各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、 Mastermind-likeprotein1和p300 mRNA的表達(dá)水平的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)方法。
　　5、各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Masterm

12、ind-likeprotein1和p300蛋白的表達(dá)水平的檢測(cè):采用Western blot方法。
　　結(jié)果：
　　1、建立心肌梗死合并糖尿病大鼠動(dòng)物模型，TTC染色結(jié)果顯示:心肌梗死合并糖尿病組大于單純心肌梗死組心肌壞死面積(p＜0.05)。
　　2、各組大鼠心肌組織病理結(jié)果顯示:Control組大鼠心肌纖維排列比較緊密，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，DM-MI大鼠心肌纖維的橫紋丟失，心肌組織溶解，心肌細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)大量藍(lán)色

13、膠原纖維組織，成纖維細(xì)胞增多。
　　3、在體實(shí)驗(yàn)中各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示:單純心肌梗死和單純糖尿病大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，并且心肌梗死合并糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞凋亡程度明顯加重(p＜0.05)。
　　4、各組大鼠血清CK-MB和TNT結(jié)果顯示:單純心肌梗死組大鼠和心肌梗死合并糖尿病大鼠血清中CK-MB和肌鈣蛋白的水平都明顯升高(P＜0.05)。
　　5、各組大鼠心肌組織中Notch1、Notch4、Jagged

14、1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示單純糖尿病大鼠和單純心肌梗死大鼠Notch通路表達(dá)均升高(P＜0.05)，而心肌梗死合并糖尿病大鼠Notch通路各指標(biāo)在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均呈下降的趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　6、各組H9C2心肌細(xì)胞活力的檢測(cè)，結(jié)果顯示:缺氧和高糖對(duì)心肌細(xì)胞H9C2有一定的損傷作用，缺氧合并高糖同時(shí)作用時(shí)心肌細(xì)胞損傷作用更為嚴(yán)重(P＜

15、0.05)，當(dāng)給予Notch通路激活劑Jagged-1后，心肌細(xì)胞損傷有所減輕(P＜0.05)，細(xì)胞活力有所提高。
　　7、各組H9C2心肌細(xì)胞調(diào)亡程度的檢測(cè)，結(jié)果顯示:缺氧和高糖促進(jìn)H9C2細(xì)胞凋亡，并且二者共同作用時(shí)凋亡細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)。在給予Notch信號(hào)通路激活劑Jagged-1后，細(xì)胞凋亡總趨勢(shì)減少(P＜0.05)，但是在早期凋亡和晚期凋亡中有輕微差異。
　　8、各組H9C2心肌細(xì)胞Notch1、Not

16、ch4、Jagged1、Dll1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示:Notch通路在缺氧和高糖刺激下的H9C2心肌細(xì)胞中被激活，而缺氧+高糖同時(shí)作用于心肌細(xì)胞Notch通路的受體和配體表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、心肌梗死合并糖尿病大鼠較單純心肌梗死大鼠心肌壞死面積更大、心肌纖維化程度更重、心肌細(xì)胞凋亡程度更加嚴(yán)重。
　　2、在單純糖尿病和單純心肌梗死大鼠的心肌組織中，Notch受體、配體以及Notch共激活