姜黃素對2型糖尿病心肌病的保護作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　糖尿病(Diabetes mellitus)嚴重危害著人類的身心健康,其發(fā)病呈快速增長和低齡化的態(tài)勢。全球糖尿病患者預(yù)計到2030年將達到439億,約3/4的糖尿病患者死于心血管疾病。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是由糖尿病引起的一種心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙,獨立于高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心臟瓣膜病及其他已知心臟疾病。DCM引起舒張期和(或)收縮期心功能改變,最終可能引發(fā)心肌

2、缺血和心衰,成為糖尿病患者的重要致死原因之一。DCM的發(fā)病機制非常復(fù)雜,目前尚未完全闡明,現(xiàn)有研究表明糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥、心肌纖維化、細胞凋亡等在DCM的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,對DCM的發(fā)病機制進行探討,并積極尋求有效防治DCM新藥具有重要的意義。
　　姜黃素(Curcumin,Cur)是從中藥姜黃中提取的一種酚性色素,分子式為C21H20O6,主鏈為不飽和脂族及芳香族基團,是一類多效的天然活性物質(zhì),毒性極低。印度和

3、中國古代曾用Cur治療糖尿病,現(xiàn)代藥理研究表明Cur具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂等藥理作用。近20余年來,國內(nèi)外學(xué)者對Cur進行了大量的基礎(chǔ)研究,發(fā)現(xiàn)Cur可以逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗,治療高血糖、高脂血癥、肥胖以及肥胖相關(guān)的代謝性疾病。據(jù)報道,Cur對糖尿病小鼠腎病具有保護作用。然而,Cur是否對DCM具有保護作用目前尚未見報道。
　　目的:
　　本研究通過高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量的鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ

4、)誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型,給予Cur干預(yù)治療,探討Cur對DCM的防治作用及可能機制,為其應(yīng)用于臨床防治DCM提供實驗及理論依據(jù)。
　　方法:
　　雄性Wistar大鼠75只,隨機抽取10只大鼠作為正常對照組(control組)給予普通飼料喂養(yǎng),其余65只大鼠給予高糖高脂飲食(基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上加入20％蔗糖和20%豬油)喂養(yǎng)8周造成胰島素抵抗后,STZ40mg/kg一次性腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型,STZ給藥72h和7d后

5、分別測定大鼠空腹血糖。兩次空腹血糖≥11.6mmol/L為糖尿病模型成功大鼠,共有44只大鼠模型成功。將糖尿病模型成功大鼠隨機分為3組:①DCM組;②Cur小劑量治療組(DCM+Cur100mg/kg);③Cur大劑量治療組(DCM+Cur200mg/kg)。藥物治療16周后,戊巴比妥鈉麻醉后彩色超聲多普勒檢測大鼠心功能變化;腹主動脈取血后分離心臟并稱量,測定心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比(heart weight/body weight,HW/B

6、W);全自動生化分析儀檢測血清心肌酶譜和脂質(zhì)變化;黃嘌呤氧化酶法測定心肌組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、比色法測定心肌組織中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性、硫代巴比妥酸(thibabituric acid,TBA)法測定組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immun

7、osorbent assay,ELISA)檢測腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)以及肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的變化;HE染色觀察心臟顯微結(jié)構(gòu)變化;Masson三色染色觀察心臟纖維化程度;電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化;免疫組織化學(xué)法測定心肌凋亡相關(guān)Bax、Bcl-2、Caspase-3以及晚

8、期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)表達變化;Caspase-3活性檢測試劑盒檢測心肌組織中Caspase-3活性變化;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)方法檢測心肌細胞凋亡變化;GST-pulldown技術(shù)

9、檢測心肌組織中Rac1活性;NADP+/NADPH試劑盒檢測心肌組織中NADP+/NADPH比值;RT-PCR方法檢測心肌中糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)mRNA基因表達;Western blot方法檢測心肌Bcl-2,Bax,RAGE,gp91phox,p47phox,蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)和糖原合成酶激酶-3β(

10、glycogen synthase kinase-3beta,GSK-3β)蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.動物體重及生化指標(biāo)測定結(jié)果顯示:實驗?zāi)?DCM組動物體重下降明顯,空腹血糖、甘油三脂(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)和HW/BW明顯升高(P<0.05),與control組比較具有顯著性差異(P<0.05)。與DCM組相比,Cur治療組大鼠空腹血糖顯著降低(P<

11、0.05),動物體重增加,HW/BW和TG下降明顯(P<0.05),但TC變化無顯著差異(P>0.05)。
　　2.超聲心動圖結(jié)果顯示:與control組比較,DCM組大鼠心率(heart rate,HR)明顯降低,心室內(nèi)徑包括左室舒張期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)和左室收縮期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,L

12、VESD)顯著擴大(P<0.05),左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LWPWT)和室間隔厚度(interventricular septal diastolic wall thickness,IVSD)增厚(P<0.05),左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)和左室射血分數(shù)(ejection fraction,EF)均顯著降低(P<0.05)

13、;與DCM組相比,Cur組尤其是DCM+Cur200mg/kg治療組可顯著升高DCM大鼠HR,降低左室內(nèi)徑(P<0.05),使IVSD變薄(P<0.05),增加FS和EF(P<0.05)。
　　3.心肌酶譜和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)結(jié)果顯示:與control組比較,DCM組血清中肌酸激酶-MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydroge

14、nase,LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amino transferase,AST)的活力以及cTnI的含量明顯升高(P<0.05),而Cur可顯著降低DCM心肌酶和cTnI的釋放,表現(xiàn)出良好的劑量依賴性(P<0.05)。
　　4.炎癥因子結(jié)果顯示:與control組比較,DCM組血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β明顯升高(P<0.05),給予Cur200mg/kg治療后DCM大鼠血清TNF-α和IL-1β含量明顯降

15、低,與DCM組比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　5.氧化應(yīng)激結(jié)果顯示:與control組比較,DCM組心肌組織中SOD和GSH-Px活力顯著減低(P<0.05),而MDA含量顯著升高(P<0.05)。Cur各劑量治療組SOD、GSH-Px活力顯著升高(P<0.05),MDA含量在DCM+Cur200mg/kg組中顯著降低,與DCM組比較有顯著差異性(P<0.05)。
　　6.心肌顯微結(jié)構(gòu)顯示:Control組大鼠心肌組

16、織結(jié)構(gòu)層次清晰,細胞排列整齊,細胞核藍染清晰可見,胞膜完整,胞漿染色均勻。DCM組大鼠心肌細胞排列紊亂,細胞空泡樣變性明顯,微血管基底膜增厚。Cur治療組心肌纖維完整,心肌細胞排列較規(guī)整,幾乎無空泡樣變性。
　　7.Masson染色結(jié)果顯示:心肌細胞染色呈紅色,間質(zhì)膠原呈藍綠色。Control組膠原組織分布均勻,相鄰細胞的膠原纖維網(wǎng)完好;DCM組心肌纖維化明顯增多,主要表現(xiàn)為血管周圍纖維化明顯;Cur組心肌纖維化較DCM組明顯減少

17、。
　　8.心肌超微結(jié)果顯示:Control組心肌細胞完整,肌纖維排列整齊,Z線、M線清晰,線粒體含量豐富且結(jié)構(gòu)正常,核膜完整。DCM組部分肌絲溶解斷裂,線粒體腫脹變性,局部或整個線粒體嵴斷裂出現(xiàn)溶解和空泡化。Cur治療組心肌纖維結(jié)構(gòu)基本正常,線粒體輕度腫脹,可見少數(shù)肌絲斷裂,心肌損傷較DCM組明顯減輕。
　　9.細胞凋亡結(jié)果顯示:DCM組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)顯著高于control組(

18、P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達減少,促凋亡蛋白Bax表達增加,Caspase-3酶活性增強(P<0.05)。與DCM組比較,Cur治療組可升高Bcl-2蛋白表達,抑制Bax蛋白表達和Caspase-3酶活性,從而降低AI(P<0.05)。
　　10.心肌組織中AGEs和RAGE表達:與control組比較,DCM組心肌組織中AGEs蛋白表達增加,RAGE的mRNA基因和蛋白表達均增加(P<0.05)。Cur可逆轉(zhuǎn)上述

19、改變,使DCM組大鼠心肌組織的AGEs和RAGE表達減少(P<0.05)。
　　11.心肌組織中NADPH氧化酶變化:與control組比較,DCM組心肌組織中NADP+/NADPH比值升高,NADPH氧化酶亞基gp91phox和gp47phox蛋白表達升高,Rac1活性增強(P<0.05)。Cur治療后可減低NADP+/NADPH比值、抑制亞基gp91phox和gp47phox蛋白表達以及Rac1活性,與DCM組比較有顯著性差異

20、(P<0.05)。
　　12.Akt/GSK-3β通路結(jié)果顯示:與control組比較,DCM組Akt和GSK-3β磷酸化減少(P<0.05)。與DCM組比較,Cur各治療組Akt和GSK-3β磷酸化增加,具有顯著性差異(P<0.05)。四組之間總Akt和GSK-3β變化無顯著性差異(P﹥0.05)。
　　結(jié)論:
　　應(yīng)用高糖高脂飲食喂飼聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射,本實驗成功的制備了2型糖尿病大鼠心肌病模型。Cur對2型