四逆湯對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)研究.pdf

1、目的：
　　膿毒癥(Sepsis)是指各種微生物(如病毒、細(xì)菌、真菌、支原體等)感染機(jī)體后引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），通過不同的免疫途徑，大量的炎癥介質(zhì)被激活并釋放入血，令機(jī)體遭受自身免疫性損傷。膿毒癥的病因多種多樣，按嚴(yán)重程度可分為膿毒癥（sepsis）、嚴(yán)重膿毒癥（severe sepsis）和膿毒性休克(septic shock)。若得

2、不得有效的調(diào)控，再進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome MODS)和多器官功能衰竭（Multiple Organ Dysfunction Failure，MOF），甚至致死。由于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制涉及到機(jī)體的多個(gè)方面反應(yīng)，如細(xì)菌內(nèi)毒素、全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、免疫功能障礙、腸道細(xì)菌/內(nèi)毒素的移位、凝血功能紊亂和基因多態(tài)性等，故其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但本質(zhì)上是機(jī)體的自身免疫性損

3、傷反應(yīng)。近年來，越來越多的膿毒癥研究報(bào)道圍繞著線粒體展開。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供了能量，有“細(xì)胞動(dòng)力工廠”之稱。除了為細(xì)胞提供能量外，線粒體還參與諸如細(xì)胞信息傳遞、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等過程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的能力。膿毒癥時(shí)，機(jī)體的免疫性損傷反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體的損傷，從而引起一系列的連鎖反應(yīng)，在臨床上表現(xiàn)為不同程度的器官功能障礙。所以目前的膿毒癥研究重點(diǎn)放在線粒體功能

4、的保護(hù)上。中藥在抗膿毒癥研究方面已有三十多年的歷史，總結(jié)了膿毒癥治療的“三證三法”，即毒熱證和清熱解毒法；瘀血證和活血化瘀法；急性虛證和扶正固本法，一定程度上使病死率降低，顯示了中藥在防治膿毒癥中的優(yōu)勢(shì)地位。本課題主要研究四逆湯對(duì)膿毒癥大鼠心肌線粒體損傷的保護(hù)。以失血和內(nèi)毒素“二次打擊”建立膿毒癥大鼠模型，并使用四逆湯進(jìn)行早期干預(yù)，擬從形態(tài)學(xué)、酶學(xué)和線粒體膜電位等指標(biāo)來反映四逆湯干預(yù)對(duì)膿毒癥大鼠心肌線粒體的保護(hù)作用，探討四逆湯是否存在整

5、體調(diào)控作用，輔助救治小兒膿毒癥，以達(dá)到降病死率、提高生存質(zhì)量的目的。
　　方法：
　　1.建立動(dòng)物模型及分組
　　SD大鼠70只，雌雄各半，每只體重200-300g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分成7組，每組10只，其中正常對(duì)照組10只，模型1d、3d、5d組各10只，四逆湯治療1d、3d、5d組各10只，分籠飼養(yǎng)。①膿毒癥模型組：實(shí)驗(yàn)前禁食12h，3％戊巴比妥鈉1ml/kg腹腔麻醉，術(shù)區(qū)剃毛，乙醇常規(guī)消毒，實(shí)驗(yàn)

6、大鼠頸動(dòng)脈穿刺放血2mL（約全血1/6量），12h后經(jīng)大鼠尾靜脈注入LPS7mg/kg。并予蒸餾水3.5ml/kg灌胃，每日1次。將動(dòng)物放回籠內(nèi)自由飲食。剔除死亡的大鼠，并重新補(bǔ)充相應(yīng)的動(dòng)物模型。②空白對(duì)照組：每只實(shí)驗(yàn)大鼠僅行頸動(dòng)脈穿刺不放血，12h后經(jīng)尾靜脈注入7ml/kg生理鹽水，并予蒸餾水3.5ml/kg灌胃，每日1次，在第3天取材。前期試驗(yàn)已證明，對(duì)照組大鼠經(jīng)上述處理后，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)血液取樣行各項(xiàng)檢測(cè)，數(shù)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③

7、四逆湯治療組：大鼠在經(jīng)歷兩次打后，予熬制好的四逆湯（濃度為生藥1g/1ml），按3.5ml/kg灌胃，每天1次，一直至相應(yīng)的取材時(shí)間點(diǎn)為止。
　　2.指標(biāo)檢測(cè)及方法
　　(1)大鼠一般情況：
　　各組大鼠在相應(yīng)的取材時(shí)點(diǎn)前測(cè)量其肛溫、心率和呼吸頻率。
　　(2)臟器的功能指標(biāo)
　　運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中的磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）和磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）。

8、r>　　(3)形態(tài)學(xué)方面的檢測(cè)
　?、偻干潆婄R下觀察線粒體形態(tài)學(xué)變化，按Flameng分級(jí)方法對(duì)心肌線粒體進(jìn)行半定量評(píng)分。
　?、诹魇郊?xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體的腫脹度。
　　(4)線粒體功能檢測(cè)
　?、偬崛〈笫笮募〖?xì)胞線粒體后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行線粒體膜電位水平的檢測(cè)。
　　②定磷法檢測(cè)大鼠心肌線粒體總ATP酶活性。
　?、郾壬y(cè)定大鼠心肌線粒體內(nèi)源性氧化應(yīng)激相關(guān)因子:SOD、GPx、NO、iNOS。

9、
　　3.統(tǒng)計(jì)方法
　　采用SPSS17．0軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(sx?）表示；多組間采用單因素方差分析；組間均數(shù)兩兩比較，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Games-Howell法；P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物生命體征的變化
　　四逆湯干預(yù)組和膿毒癥模型組均出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)癥狀體征，如肛溫升高、心率加快、呼吸變促等。
　　2.臟器功能

10、指標(biāo)
　　(1)血清CK水平
　　與對(duì)照組比較，1d模型組和SND干預(yù)組CK值均明顯升高2倍以上，有顯著性差異（P值均<0.01）；3、5d模型組和SND干預(yù)組CK值均明顯下降，比較無顯著性差異。與模型組比較，3dSND治療組CK值下降更明顯，有顯著性差異（P<0.01）。
　　(2)血清CK-MB水平
　　與對(duì)照組比較，各模型組和SND干預(yù)組CK-MB值均明顯升高，其中1、3、5d模型組和1dSND干預(yù)組數(shù)值有

11、顯著性差異（P值均<0.01）。與模型組比較，1、3、5dSND干預(yù)組CK-MB值均明顯下降，有顯著性差異（P<0.01，P<0.01，P<0.05）。
　　3．形態(tài)學(xué)檢測(cè)
　　(1)電鏡形態(tài)學(xué)觀察及半定量分析
　　與對(duì)照組比較，1、3、5d模型組和1d治療組線粒體電鏡半定量評(píng)分明顯升高(P值均<0.01)。與模型組比較，3、5d治療組線粒體電鏡半定量評(píng)分明顯下降(P值均<0.01)。
　　(2)線粒體腫脹程度<

12、br>　　與對(duì)照組比較，1、3、5d模型組心肌線粒體腫脹程度明顯升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05）。與模型組比較，1、3、5d干預(yù)組心肌線粒體腫脹程度明顯下降（P<0.01，P<0.05，P<0.01），但與對(duì)照組比較，數(shù)值仍升高，比較無顯著性差異。
　　4.線粒體功能檢測(cè):
　　(1)線粒體膜電位檢測(cè)
　　與對(duì)照組比較，1、3、5d模型組心肌線粒體膜電位明顯下降，比較有顯著性差異（P<0.01，P<0.

13、01，P<0.05）。與模型組比較，1、3d干預(yù)組心肌線粒體膜電位明顯升高，比較有顯著性差異（P<0.01，P<0.01）。
　　(2)總ATP酶活性
　　與對(duì)照組比較，1d模型組總ATP酶活性數(shù)值明顯下降（P<0.01）；3d模型組數(shù)值也有下降，但無顯著性差異；5d模型組數(shù)值明顯升高，比較有顯著性差異（P<0.01）。與模型組比較，1、3、5d干預(yù)組總ATP酶活性數(shù)值均明顯升高，有顯著性差異（P<0.01，P<0.05，P

14、<0.01）。
　　5.線粒體內(nèi)源性氧化應(yīng)激相關(guān)因子
　　(1)與對(duì)照組比較，1、3d模型組心肌線粒體SOD活性明顯下降，比較有顯著性差異（P<0.01，P<0.01）；5d模型組 SOD活性有所回升，比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，1、3d干預(yù)組心肌線粒體SOD活性明顯上升，比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）。
　　(2)與對(duì)照組比較，1、3d模型組心肌線粒體GPx活性下降，比較有顯著性差異（P<0.05

15、，P<0.05）。與模型組比較，1、3、5d干預(yù)組心肌線粒體GPx活性均有提高，比較有顯著性差異（P<0.01，P<0.01，P<0.05）。
　　(3)與對(duì)照組比較，1d模型組心肌線粒體NO含量明顯下降（P<0.01），但3、5d模型組NO含量有所下降，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；干預(yù)組各時(shí)間段NO含量與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn) NO含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(4)與對(duì)照組比較，1、3d模型

16、組心肌線粒體iNOS活性有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5d模型組iNOS活性升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)iNOS活性升高與對(duì)照組比較均有顯著性差異（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。與模型組比較，干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)iNOS活性均明顯升高，有顯著性差異（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。6.相關(guān)性分析
　　(1)大鼠心臟線粒體膜電位與血清CK、CK-MB水平呈具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為

17、－0.472（P<0.01）和－0.428（P<0.01）。
　　(2)大鼠心臟線粒體膜電位與SOD、GPx和總ATP酶水平呈具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.511（P<0.01）、0.326（P<0.05）和0.486（P<0.01）。
　　(3)大鼠心肌線粒體膜電位與線粒體NO含量、iNOS活性均無顯著的相關(guān)性（r＝0.238，P>0.05；r＝0.111，P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．