UCP2在膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體中的作用及初步機制探討.pdf

1、目的及意義：
　　本課題在構建UCP2過表達及RNAi沉默UCP2的穩(wěn)轉株心肌細胞基礎上，用脂多糖及肽聚糖混合制劑刺激細胞，通過檢測心肌細胞線粒體的形態(tài)，線粒體腫脹度、線粒體膜電位、線粒體ROS及氧化應激指標、線粒體ATP含量、線粒體mtDNA等指標，揭示UCP2在膿毒癥心肌細胞線粒體中的保護作用及機制，為臨床治療膿毒癥時心肌損傷提供基礎理論支持。
　　方法：
　　1、實驗分組
　　①RNA干擾篩選實驗分組:篩選

2、有效的UCP2干擾基因片段。將H9C2心肌細胞隨機分成五組，分別為:①Control組，給予等量的生理鹽水;②Lipofectamine組，給予等量的Lipofectamine2000;③siRNA1組，給予siRNA1干擾序列;④siRNA2組，給予siRNA2干擾序列;⑤ncRNA組，給予ncRNA序列。上述各siRNA的終濃度為80 nmol/l。
　?、诟蓴_實驗分組:將H9C2心肌細胞隨機分成四組，分別為:①Control

3、組，給予生理鹽水刺激;②LPS/PepG組，給予LPS及PepG刺激;③LPS/PepG+siRNA組，給予LPS及PepG刺激后予siRNA干預;④LPS/PepG+ncRNA組，給予LPS及PepG刺激后予ncRNA干預。上述LPS的終濃度為2μg/ml，PepG的終濃度為20μg/ml。
　　③過表達細胞分組:將H9C2心肌細胞隨機分成四組，分別為:①Control組，給予生理鹽水刺激;②LPS/PepG組，給予LPS及Pe

4、pG刺激;③PHBLV組，空病毒載體轉染H9C2細胞，然后給予LPS及PepG刺激;④PHBLV-UCP2組，然后給予LPS及PepG刺激UCP2過表達H9C2細胞。上述LPS的終濃度為2μg/ml，PepG的終濃度為20μg/ml。
　　2、RNA干擾實驗
　　①結合文獻及前期實驗結果，按照RNA干擾片段設計方法，設計2條RNA干擾片段，先進行預實驗，確定有效的siRNA;然后以此siRNA作為干擾片段，進行RNA干擾實驗

5、;
　?、趯iRNA轉染心肌細胞，然后觀察其在膿毒癥條件下，對線粒體形態(tài)及功能的影響。
　　3、UCP2過表達慢病毒載體的構建及穩(wěn)定心肌細胞株的篩選
　　①提取大鼠總的RNA，反轉錄得到cDNA，調取UCP2目的基因并進行PCR擴增，電泳回收目的基因。pMD19-T載體（克隆載體）與UCP2目的基因的連接，然后轉染新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并測序。②從UCP2重構的T質粒中擴增目的基因，然后與慢病毒穿梭載

6、體pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro進行連接;然后將連接產(chǎn)物進行轉化及擴增、并測序。③慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，共轉染293T細胞，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，過濾并超離心濃縮病毒，并進行濃度滴定。④慢病毒感染穩(wěn)定細胞系，慢病毒感染心肌細胞后，用嘌呤霉素進行篩選，直至篩選完全。因載體能合成抗篩選藥物的蛋白而得以存活，以空載的細胞為陰性對照實驗。經(jīng)PCR及WB驗證，證實UCP2過表達H9C2細胞株建立

7、成功，可進行下一步實驗。
　　4、膿毒癥心肌細胞模型指標:CK及LDH，IL-6及TNF-α水平
　　①比色法檢測肌酸激酶:用多功能酶標儀，按照南京建成的檢測肌酸激酶測試盒說明書，進行操作。
　?、诒壬z測乳酸脫氫酶:用多功能酶標儀，按照南京建成的檢測乳酸脫氫酶(LDH)測試盒說明書進行操作。
　?、跡LISA法檢測IL-6水平:根據(jù)試劑盒說明進行操作。試劑盒為:Rat Interleukin6(IL-6) E

8、LISA Kit, Cusabio Life Science, Wuhan, China。
　?、蹺LISA法檢測TNF-α水平:根據(jù)試劑盒說明進行操作。試劑盒為:Rat TNF-αELISA Kit, Cusabio Life Science, Wuhan, China。
　　5、線粒體形態(tài)分析:電鏡觀察線粒體形態(tài)學變化，流式細胞儀檢測線粒體腫脹度
　?、匐婄R觀察標本制備:培養(yǎng)并收集心肌細胞，先用3％戊二醇固定，再予

9、1％餓酸后固定，用酒精脫水，然后置換、包埋、浸透、包埋。電鏡修塊，在AO超薄切片機下切1μM的半薄切片，飽和醋酸雙氧鈾染后電鏡下觀察。
　?、诰€粒體腫脹度檢測:采用流式細胞儀(flow cytometry, FCM)常規(guī)的綠色熒光(FITC-H)和紅色熒光(PI-H)進行檢測，以紅色熒光強度/綠色熒光強度計算膜電位，比值可間接反映線粒體膜電位變化。以前向角散射(forward scatter,FSC)和側向角散(sidescatt

10、er, SSC)平均熒光強度的比值(FSC/SSC)反應線粒體腫脹度。
　　6、激光共聚焦顯微鏡定性觀察線粒體膜電位與流式細胞儀定量分析膜電位
　　①激光共聚焦顯微鏡定性觀察線粒體膜電位:采用JC-1染色，原理與流式細胞儀檢測一致。在6孔培養(yǎng)板上H9C2心肌細胞用JC-1進行熒光染色，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，紅色熒光與綠色熒光的比例代表了線粒體膜電位。
　　②流式細胞儀定量分析線粒體膜電位:采用一種陽離子脂質熒光

11、染JC-1作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時以單體的形式存在，高濃度時以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位升高時，JC-1聚合體形式增加，F(xiàn)L-2/FL-1比值升高;線粒體膜電位下降時，JC-1單體形式增加，F(xiàn)L-2/FL-1比值降低。
　　結果：
　　1、膿毒癥細胞模型成功建立:我們用來自金黃色葡萄球菌細胞壁上的PepG與來自革蘭陰

12、性菌LPS組成混合劑，刺激H9C2心肌細胞后，檢測到Lps/PepG組細胞培養(yǎng)液中的CK、LDH、及IL-6、TNF-α的水平明顯高于Control組。Control組線粒體邊界清楚，基質均勻，線粒體嵴致密，形態(tài)大致正常。Lps/PepG組線粒體邊界模糊不清，體積明顯腫脹，基質密度降低，部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解，甚至嵴斷裂現(xiàn)象，可見空泡樣變。這提示膿毒癥的細胞模型構建成功。
　　2、RNA干擾片段篩選結果:與Control組

13、相比，SiRNA1組和SiRNA2組UCP2-mRNA基因拷貝數(shù)明顯降低，分別下降了59％和69％，差異有統(tǒng)計學意義，故選擇SiRNA2干擾片段作為后續(xù)UCP2基因干擾實驗。
　　3、UCP2基因的表達結果:①干擾實驗顯示:Lps/PepG+siRNA組的UCP2蛋白相對密度值和UCP2 mRNA表達相對拷貝數(shù)均明顯低于Control組及Lps/PepG組;②過表達實驗顯示:PHBLV-UCP2組的UCP2蛋白相對密度值及UCP2

14、-mRNA相對拷貝數(shù)均明顯高于Control組及Lps/PepG組。這說明干擾實驗及過表達實驗基因構建是成功的。
　　4、UCP2沉默及過表達對CK、LDH、及IL-6、TNF-α的水平影響:①干擾實驗顯示:Lps/PepG+siRNA組的CK水平及LDH水平明顯高于Lps/PepG組;Lps/PepG+siRNA組的TNF-α水平及IL-6水平均明顯高于Lps/PepG組，這提示干擾UCP2導致膿毒癥細胞損傷及炎癥因子釋放進一步

15、加重。②過表達實驗顯示:PHBLV-UCP2組的的CK水平和LDH水平均明顯低于Control組及Lps/PepG組;PHBLV-UCP2組的IL-6水平和TNF-α水平均明顯低于Lps/PepG組，這提示UCP2過表達抑制膿毒癥細胞損傷及炎癥因子的進一步釋放。
　　5、線粒體腫脹度:①干擾實驗顯示:與Lps/PepG組相比，Lps/PepG+siRNA組FSC/SSC值明顯升高，且線粒體形態(tài)損壞更加明顯，表現(xiàn)為線粒體腫脹明顯，基

16、質密度降低顯著，可見內(nèi)膜破裂及嵴斷裂，空泡樣變更加明顯;這提示干擾UCP2導致膿毒癥線粒體損傷加重。②過表達實驗顯示:與Lps/PepG組相比，PHBLV-UCP2組的FSC/SSC值明顯將低，線粒體形態(tài)損壞有所改善，表現(xiàn)為線粒體腫脹減輕，基質密度增高，內(nèi)膜破裂及嵴斷裂減少，空泡樣變不明顯;這提示UCP2過表達有利于保護膿毒癥線粒體。
　　6、線粒體膜電位:①干擾實驗顯示:與Lps/PepG組相比，Lps/PepG+siRNA組的

17、紅色熒光/綠色熒光比值明顯增高， MMP明顯增高;②過表達實驗顯示:與Lps/PepG組相比， PHBLV-UCP2組的紅色熒光/綠色熒光比值明顯上升，MMP明顯增高;但PHBLV-UCP2組MMP的幅度沒有Lps/PepG+siRNA組高。這提示:UCP2可以調控膜電位水平，但具體調控程度尚不明確。
　　結論:
　　UCP2在膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體損傷中起著保護作用，其機制可能是:UCP2通過解耦聯(lián)作用調控線粒體膜電位，