Apoptin對膀胱移行細胞癌抑制增殖和誘導凋亡作用研究.pdf

1、膀胱移行細胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居高不下，臨床上主要以手術、放化療和免疫治療為主，雖能明顯的延長患者的生存期，但因其具有多發(fā)和易復發(fā)的特點，遠期療效及患者生活質(zhì)量并不令人滿意，尤其是中、晚期患者，往往喪失了手術機會。作為一種有望徹底治愈腫瘤的治療方式，腫瘤基因治療雖然開展較晚，卻擁有廣闊的前景。近年來，伴隨分子生物學、細胞生物學的發(fā)展及各種癌基因、抑癌基因的發(fā)現(xiàn)，腫瘤基因治療獲得了極大進步，并取得了可喜的成績。腫瘤基因治

2、療的關鍵是靶向性殺傷，既要有效殺傷腫瘤細胞，又不能殺傷或干擾正常細胞。缺乏腫瘤細胞靶向性是限制基因治療不能廣泛應用于臨床的瓶頸。具有特異性腫瘤殺傷作用的基因是腫瘤基因治療的理想選擇。 Apoptin是由雞貧血病毒VP3基因編碼的凋亡功能蛋白，包含121個氨基酸，分子量為13.6KD，不與任何已知蛋白同源。研究表明，Apoptin具有廣譜的誘導腫瘤細胞凋亡效應，能誘導卵巢癌、肝癌、惡性淋巴瘤等多種腫瘤細胞凋亡，而對正常淋巴、真皮、

3、上皮、內(nèi)皮等人正常和原代二倍體細胞無殺傷及毒性作用，尤其是對化療藥物及放射治療極為敏感的二倍體細胞，如骨髓來源的造血干細胞CD34+和間葉干細胞及淋巴細胞等，均不受Apoptin誘導的凋亡影響，不同途徑給藥亦未發(fā)現(xiàn)Apoptin的毒性效應，這均說明其具有潛在的抗腫瘤應用價值。因此，本研究將此外源性基因引入膀胱癌的基因治療，構建能表達Apoptin的真核表達質(zhì)粒，以EGFP為報告基因，脂質(zhì)體介導瞬時轉染膀胱移行細胞癌T24細胞，從體外培養(yǎng)

4、和移植瘤模型兩方面研究Apoptin對膀胱癌的治療作用，并對其與化療藥物順鉑的聯(lián)合應用可行性做初步探討。 研究目的： 1.探討Apoptin對體外培養(yǎng)的T24細胞增殖、凋亡、細胞周期的影響。 2.探討Apoptin對人膀胱癌裸鼠移植瘤的治療作用。 3.探討Apoptin與化療藥物順鉑對T24的協(xié)同殺傷作用。 研究內(nèi)容和方法： 1.EGFP標記的Apoptin真核表達質(zhì)粒的構建及鑒定：以變異

5、型Apoptin質(zhì)粒p3×flag-m-Apoptin-myc為模板，根據(jù)NCBIGenBank登錄的野生型Apoptin基因序列設計引物，矯正變異堿基，擴增出野生型Apoptin基因片斷，并將其定向克隆于以EGFP作為報告基因的載體pEGFP-N1中，構建能表達Apoptin-EGFP融合蛋白的重組質(zhì)粒pApoptin-EGFP，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、電泳初步確認，送上海生工測序鑒定。 2.Apoptin對膀胱癌T24細胞的誘導凋

6、亡作用：脂質(zhì)體介導，將重組質(zhì)粒瞬時轉染膀胱癌T24細胞，RT-PCR檢測ApoptinmRNA表達，倒置熒光顯微鏡觀察融合蛋白表達，MTT檢測轉染后不同時相點T24增殖抑制，凋亡光學試劑盒檢測轉染后T24細胞形態(tài)變化和凋亡率，流式細胞儀檢測凋亡率和細胞周期。 3.Apoptin對膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的治療作用：皮下注射T24.細胞，建立人膀胱移行細胞癌裸鼠移植瘤模型，于腫瘤直徑0.5cm大小時，采用多點注射的方法，將脂質(zhì)體包裹的

7、質(zhì)粒pApoptin-EGFP導入T24裸鼠移植瘤，設立空質(zhì)粒組、生理鹽水組作為對照組，觀察裸鼠及移植腫瘤生長情況；5周后處死荷瘤鼠，繪制移植瘤生長曲線，計算抑瘤率，腫瘤組織石蠟包埋，常規(guī)切片，H.E.染色觀察組織細胞形態(tài)，TUNEL法檢測移植瘤組織細胞調(diào)亡。 4.Apoptin與順鉑(DDP)對T24細胞的殺傷及協(xié)同作用：梯度濃度的順鉑作用于轉染pApoptin-EGFP和空質(zhì)粒的T24.細胞，MTT法檢測順鉑作用24小時后T

8、24細胞增殖，流式細胞儀檢測凋亡，金氏法判斷質(zhì)粒轉染與順鉑干預是否具有協(xié)同作用。 實驗結果： 1.通過酶切電泳及測序鑒定，確認已成功擴增出野生型Apoptin基因，與GenBank登陸序列完全一致，在EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點間正確插入pEGFP-N1載體內(nèi)，方向及編碼序列正確，與EGFP編碼序列構成完整閱讀框，無移碼突變，成功構建理論上能表達Apoptin.EGFP融合蛋白的真核表達質(zhì)粒pApoptin-EGFP。

9、 2.瞬時轉染人膀胱癌T24.細胞后，RT-PCR檢測到ApoptinmRNA表達；熒光顯微鏡下可見綠色熒光，說明融合蛋白能在真核細胞T24中順利表達；MTT檢測T24細胞增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)轉染apoptin對膀胱移行細胞癌T24細胞生長具有明顯抑制作用，24h、48h、72h抑制率分別(19.4±3.76)％，(37.5±4.66)％和(49.5±4.15)％；與空質(zhì)粒對照組相比，抑制率顯著增高。經(jīng)過凋亡光學試劑盒檢測，Apo

10、ptin的瞬時轉染可引起細胞核高度凝聚，染色質(zhì)密集、呈邊緣化等凋亡特征性表現(xiàn)，經(jīng)計數(shù)，凋亡率約為(21.25±1.98)％，而空質(zhì)粒組僅為(7.3±1.04)％。流式細胞儀Annexin-Ⅴ/PⅠ法檢測細胞轉染率和凋亡，轉染后48小時，pApoptin-EGFP組早期調(diào)亡率為(18.7±1.13)％，pEGFP-N1組為(4.97±0.57)％，兩者具有非常顯著差異(P＜0.01)；晚期調(diào)亡細胞Apoptin組為(19.2±1.99)％

11、，較對照組(2.7±1.73)％同樣有非常顯著的提高，進一步說明Apoptin能顯著誘導T24細胞凋亡。流式細胞儀檢測24h、48h、72h三個時相點細胞周期變化，發(fā)現(xiàn)瞬時轉染空質(zhì)粒24h可引起S期細胞減少，G1、G2/M期輕度阻滯，隨時間推移，以上變化逐漸減弱，72小時基本接近空白對照組，而轉染pApoptin-EGFP重組質(zhì)粒的T24細胞S期細胞比例顯著減少，并隨時間推移，變化逐漸加大，72小時尤為明顯，已由46.8％持續(xù)下降到28

12、.5％，G1/G0和G2/M期均有上升，呈現(xiàn)雙阻滯現(xiàn)象。 3.成功構建人膀胱移行細胞癌裸鼠移植瘤模型；注射pApoptin-EGFP質(zhì)粒的荷瘤鼠精神狀態(tài)較好，飲食正常，體重增加，無消瘦等惡病質(zhì)表現(xiàn)；腫瘤體積小，形態(tài)較規(guī)則，生長緩慢，處死剝離時與周圍組織無明顯粘連，凈重平均為0.26±0.08g。生理鹽水組和空白質(zhì)粒組荷瘤鼠精神狀態(tài)差，不喜活動，食欲差，毛色晦暗，消瘦；腫瘤生長速度較快，形態(tài)欠規(guī)則，處死剝離時與周圍組織明顯粘連，凈

13、重分別為1.02±0.23g和0.83±0.20g。以生理鹽水組作對照，pApoptin-EGFP質(zhì)粒注射組和空質(zhì)粒組腫瘤抑制率分別為74.5％和18.6％，兩者差異明顯。三組移植瘤組織切片H.E染色提示三組細胞核大、深染，組織結構紊亂，符合腫瘤細胞特征，pApoptin-EGFP質(zhì)粒注射組染色質(zhì)濃縮、聚集的細胞明顯增多；TUNEL染色示pApoptin-EGFP、pEGFP-N1、生理鹽水三組凋亡率分別為(23.24±6.12)％，(

14、3.52±1.20)％和(1.76±0.44.)％，pApoptin-EGFP注射組與空白質(zhì)粒注射組、生理鹽水注射組相比，凋亡率有非常顯著差異。說明Apoptin作為外來基因產(chǎn)物對人膀胱癌T24裸鼠移植瘤具有明顯的抑瘤作用，治療期間未見明顯的毒、副作用。 4.隨順鉑(DDP)濃度的增加，DDP、pEGFP-N1+DDP、pApoptin-EGFP+DDP三組T24細胞抑制率逐漸增高；除64ug/ml濃度組外每個劑量點的pApop

15、tin-EGFP+DDP組IR值均比：DDP、pEGFP-N1+DDP組為高，差異顯著，具統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；64ug/ml組因抑制效應已屬平臺期，故僅呈增高趨勢，卻無統(tǒng)計學意義；經(jīng)計算，DDP、pEGFP-N1+DDP和pApoptin-EGFP+DDP三組的：IC50分別為10.61ug/ml，7.9ug/ml和2.4ug/ml；經(jīng)金氏法計算和分析，確認pApoptin-EGFP質(zhì)粒轉染與DDP干預對T24的抑制增殖效應具有

16、協(xié)同作用，而轉染空質(zhì)粒與DDP干預的作用僅為簡單相加；同法分析可見pApoptin-EGFP和DDP誘導T24細胞凋亡效應同樣具有協(xié)同作用，而空質(zhì)粒與DDP誘導凋亡效應僅為簡單相加。 結論： 1.構建了pApoptin-EGFP重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒能在膀胱癌T24細胞中順利表達Apoptin-EGFP融合蛋白。 2.與空質(zhì)粒相比，Apoptin能明顯的抑制T24細胞增殖，誘導T24細胞凋亡，阻滯細胞周期于G1/G0和