紫杉醇誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡和抑制膀胱腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱癌的新診病例中70％為淺表性膀胱癌，淺表性膀胱癌的首選治療為經(jīng)尿道切除。膀胱癌經(jīng)尿道切除后仍有較高的復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率。膀胱灌注治療可以殺死殘留的腫瘤細(xì)胞、降低復(fù)發(fā)率、延長(zhǎng)復(fù)發(fā)間隔，也可能防止腫瘤進(jìn)展，是淺表性膀胱癌經(jīng)尿道切除術(shù)后的常規(guī)輔助治療。 目前紫杉醇已是國(guó)際上繼阿霉素和含鉑類抗癌藥物之后的熱點(diǎn)抗腫瘤薪藥。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)紫杉醇用于轉(zhuǎn)移性卵巢癌和乳腺癌等的治療。紫杉醇是一種作用于有絲分裂紡錘體的藥物，阻滯真核細(xì)胞于G<

2、,2>/M期。低濃度時(shí)通過改變微管動(dòng)力學(xué)變化，限制細(xì)胞有絲分裂，引起細(xì)胞體積和DNA含量異常，造成細(xì)胞死亡；高濃度時(shí)造成穩(wěn)定的微管束形成，增加了微管聚合體團(tuán)塊體積，導(dǎo)致G<,2>/M期阻滯和細(xì)胞凋亡。紫杉醇對(duì)膀胱腫瘤具有顯著的療效，為目前所知膀胱腫瘤單藥化療之最，已進(jìn)入臨床Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)。在評(píng)價(jià)紫杉醇的抗腫瘤作用中，凋亡是重要的指標(biāo)和機(jī)制之一。 MNU誘導(dǎo)的膀胱腫瘤與人膀胱腫瘤的發(fā)生和生物學(xué)行為類似，經(jīng)歷從原位癌、肌層浸潤(rùn)

3、和死亡的全過程，而且發(fā)現(xiàn)多種治療藥物對(duì)其誘導(dǎo)的晚期腫瘤無效，對(duì)早期腫瘤則效果明顯，這也符合臨床膀胱腫瘤治療的普遍情況。因此，可以用該模型進(jìn)行膀胱腫瘤化療的研究。 本實(shí)驗(yàn)以人膀胱癌EJ細(xì)胞株為靶細(xì)胞，觀察不同濃度紫杉醇作用后EJ細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，以及紫杉醇誘導(dǎo)EJ細(xì)胞凋亡及抑制增殖的作用，并探討其作用的時(shí)間、劑量一效應(yīng)關(guān)系，分析紫杉醇誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為紫杉醇用于膀胱癌的治療提供理論依據(jù)。因?yàn)樽仙即伎赡芡ㄟ^藥理作用，誘

4、導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，本研究用紫杉醇對(duì)MNU誘導(dǎo)的大鼠膀胱腫瘤模型進(jìn)行膀胱灌注，并以細(xì)胞增殖周期比例、微血管密度和凋亡指數(shù)為指標(biāo)對(duì)紫杉醇的抑瘤作用機(jī)制進(jìn)行探討。體外培養(yǎng)人膀胱癌EJ細(xì)胞，以1、10、100、1000nmol/L紫杉醇處理12～72h后，應(yīng)用MTT比色法測(cè)定不同濃度紫杉醇對(duì)EJ細(xì)胞增殖的影響，并繪制劑量一效應(yīng)曲線；通過電鏡觀察檢測(cè)細(xì)胞凋亡；采用PI單染法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膀胱癌EJ細(xì)胞的凋亡率，測(cè)定細(xì)胞周期。

5、 雌性Wistar大鼠100只，100～12周齡，體重240±20克，隨機(jī)分成A、B、C、D和E共5組，每組20只。A組，膀胱灌注枸櫞酸緩沖液O．2mL，每2周一次，共4次，于第一次灌注后第8周行生理鹽水O.5mL膀胱灌注每周1次共6次；B、C、D和E組大鼠膀胱灌注MNU溶液0.2mL，每2周一次，共4次，誘導(dǎo)膀胱癌。B、C、D和E組于第一次灌注后第8周分別行生理鹽水、魚軟骨多糖溶液、草分枝桿菌制劑和紫杉醇二甲亞砜溶液O.5mL

6、膀胱灌注，每周1次共6次。于最后1次灌注后24小時(shí)以膀胱絕對(duì)重量與體重的比值(膀胱相對(duì)重量)作為膀胱腫瘤的生長(zhǎng)參數(shù)進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析。并于第8、14周每組隨機(jī)抽取2只大鼠，病理學(xué)檢查。 B和E組膀胱標(biāo)本病變明顯處取材，置人10％中性福爾馬林溶液中固定，制作石蠟包埋標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法以CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮測(cè)定微血管密度。其余腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液以Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比率；另吸取單細(xì)

7、胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。 結(jié)果： 紫杉醇能抑制EJ細(xì)胞的生長(zhǎng)，并在一定劑量和時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)出時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。電鏡下凋亡細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮致密，并沿核膜分布形成新月形。流式細(xì)胞儀檢測(cè)觀察到細(xì)胞周期阻滯于G<,2>/M期，高濃度(100、1000nmol/L)明顯出現(xiàn)凋亡峰，細(xì)胞的凋亡率隨紫杉醇濃度的增大而增加。 大鼠膀胱灌注MNU溶液后第8周時(shí)，B、C、D和E組均發(fā)生病變。粘膜上皮增生可達(dá)10層，

8、可見非典型增生和出現(xiàn)移行細(xì)胞癌I級(jí)。14周時(shí)，可見明顯膀胱腫瘤，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)可達(dá)肌層，腫瘤細(xì)胞異型明顯，有的表現(xiàn)為癌細(xì)胞高度未分化，移行上皮結(jié)構(gòu)特征完全消失，呈彌漫分布或排列成實(shí)體性癌巢。第14周B組大鼠膀胱重量大于A組；C、D和E等3個(gè)用藥組膀胱重量均小于B組，其中E組膀胱重量與B組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。E組G<,2>/M期的腫瘤細(xì)胞多于B組，而S期腫瘤細(xì)胞少于B組；E組腫瘤細(xì)胞的凋亡率高于B組，而微血管密度低于B組。 紫杉醇能抑

9、制膀胱癌EJ細(xì)胞的生長(zhǎng)，在一定劑量范圍內(nèi)呈時(shí)間濃度依賴性；紫杉醇能夠誘導(dǎo)EJ細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率隨紫杉醇濃度的增大而增加。 MNU誘導(dǎo)的膀胱腫瘤模型與人膀胱腫瘤的發(fā)生和生物學(xué)行為類似，其早期腫瘤適合評(píng)價(jià)藥物對(duì)膀胱癌的治療作用。草分枝桿菌制劑和(魚,工)魚軟骨多糖連續(xù)膀胱灌注未表現(xiàn)出對(duì)膀胱腫瘤明顯的抑制作用，而紫杉醇二甲亞砜溶液則顯示出強(qiáng)大的抑制膀胱腫瘤生長(zhǎng)的作用。紫杉醇灌注使膀胱腫瘤G<,2>/M期細(xì)胞增多，誘導(dǎo)大鼠膀胱腫瘤