EHMT2抑制劑(BIX-01294)誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的:
　　膀胱癌屬于人體全身十大最常見(jiàn)腫瘤。2012年全球新增膀胱癌病例43萬(wàn)，死亡病例16.5萬(wàn)。2012年我國(guó)腫瘤登記地區(qū)膀胱癌發(fā)病率為6.61/10萬(wàn)，位列我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率第9位，居我國(guó)泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病第一位。
　　臨床膀胱癌治療方法的選擇取決于腫瘤侵潤(rùn)膀胱壁的程度。電切術(shù)、全膀胱切除術(shù)治療或膀胱部分切除術(shù)后，患者預(yù)后不佳，復(fù)發(fā)率極高。目前，基于順鉑的聯(lián)合化療方案（M-VAC方案）和順鉑方案（GC方案）已成

2、為可以耐受順鉑的膀胱癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但卻無(wú)法回避化療藥物的毒副作用。而根據(jù)腫瘤標(biāo)記物及其所在通路對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行靶向治療，不僅不會(huì)波及腫瘤周圍的正常組織細(xì)胞能有效殺傷癌細(xì)胞，可減少副作用，而且可提高患者耐受性，有很大臨床應(yīng)用前景。而包括西妥昔單抗、貝伐珠單抗等在內(nèi)的膀胱癌靶向藥物在臨床研究階段并未表現(xiàn)出明顯的治療效果。故針對(duì)膀胱癌的靶向藥物的開(kāi)發(fā)和試驗(yàn)成為目前亟待解決的問(wèn)題。
　　作為常染色質(zhì)組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶2(E

3、uchromatic histone-lysineN-methyltransferase2，EHMT2)的抑制劑，BIX-01294已被報(bào)道可以抑制膀胱癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。我們通過(guò)前期藥物篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BIX-01294能夠明顯抑制人類膀胱癌細(xì)胞的增殖。然而，BIX-01294誘導(dǎo)人類膀胱癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制還尚無(wú)報(bào)道。本課題旨在闡明在BIX-01294誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1

4、.磺酰羅丹明B(SRB)比色法檢測(cè)BIX-01294對(duì)人膀胱癌細(xì)胞存活率的影響。
　　2.免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)BIX-01294處理后人膀胱癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平變化。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BIX-01294誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞凋亡的改變。
　　4.siRNA干擾技術(shù)和外源表達(dá)研究EHMT2、PMAIP1、MCL1、USP9X、DDIT3、TNFRSF10A等基因在BIX-01294誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞

5、凋亡過(guò)程中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.BIX-01294抑制T24和5637這兩種人膀胱癌細(xì)胞的存活，并呈劑量依賴性。并且BIX-01294能激活凋亡蛋白酶CASP級(jí)聯(lián)反應(yīng)，具有劑量和時(shí)間依賴效應(yīng);且在敲低EHMT2后增強(qiáng)了BIX-01294誘導(dǎo)的CASP級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
　　2.BIX-01294上調(diào)T24和5637細(xì)胞中PMAIP1的表達(dá)，同時(shí)能夠下調(diào)MCL1的表達(dá)，具有劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。在T24和5637細(xì)胞中

6、敲低PMAIP1和過(guò)表達(dá)MCL1均能夠拯救BIX-01294引起的凋亡。
　　3.BIX-01294下調(diào)T24和5637細(xì)胞中USP9X的表達(dá)，具有劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。敲低USP9X可以下調(diào)MCL1同時(shí)增強(qiáng)BIX-01294誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　4.BIX-01294上調(diào)T24和5637細(xì)胞中DDIT3的表達(dá)，具有劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。敲低DDIT3可以拯救BIX-01294誘導(dǎo)的凋亡。
　　5.BIX-01294在T2

7、4和5637細(xì)胞中上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白HSPA5、ERN1和ATF4，并具有劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。
　　6.在T24和5637細(xì)胞中敲低CASP8能夠削弱BIX-01294誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。BIX-01294上調(diào)T24和5637細(xì)胞中TNFRSF10A的表達(dá)，具有劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。敲低TNFRSF10A可以削弱BIX-01294誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　7.在T24和5637細(xì)胞中敲低DDIT3使BIX-01294引起的TN

8、FRSF10A表達(dá)上調(diào)的程度減弱。
　　結(jié)論:
　　1.BIX-01294能夠誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞凋亡，并與其抑制EHMT2的功能有關(guān)。
　　2.BIX-01294誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。
　　3.BIX-01294通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，激活PMAIP1-USP9X-MCL1通路，引發(fā)膀胱癌細(xì)胞內(nèi)源途徑凋亡。
　　4.BIX-01294通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)TNFRSF10A，從而引起人膀胱癌細(xì)胞外