羥基喜樹堿誘導人膀胱癌細胞凋亡及其機制的研究.pdf

1、目的：膀胱癌是人類常見惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人們的生命和健康。膀胱癌在我國泌尿系腫瘤中的發(fā)病率占第1位，復發(fā)率高是其顯著特點，因此絕大多數(shù)患者在進行腫瘤切除手術(shù)后需進行膀胱灌注化療。為了尋找一種更為有效的灌注化療藥物，國內(nèi)外學者都在進行不懈的努力。羥基喜樹堿(HCPT)是從珙桐科植物喜樹中提取得到的生物堿，從上世紀80年代開始應用于膀胱癌灌注化療，并成為臨床上進行膀胱癌化療常用的藥物之一，但其抗癌作用機制目前、尚不十分清楚。近年研究發(fā)

2、現(xiàn)，誘導細胞凋亡是HCPT發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制。Bcl-2基因是Bcl-2基因家族中最早被發(fā)現(xiàn)，也是最重要的抗凋亡基因。有研究發(fā)現(xiàn)，很多凋亡刺激因素誘導細胞凋亡過程中，伴有Bcl-2蛋白表達水平的下調(diào)。降低Bcl-2蛋白表達水平可能是凋亡刺激因素誘導細胞凋亡的重要機制。 本研究應用HCPT作用于體外培養(yǎng)的人膀胱癌T24．細胞，觀察其作用效果，并檢測藥物作用后人膀胱癌1-24細胞的Bcl-2蛋白的表達水平，探討羥基喜樹堿對人膀

3、胱癌T24細胞的凋亡誘導作用及其機制，深入研究羥基喜樹堿的生物學作用及其機制對膀胱癌的治療具有重要的意義。 方法: 一、MTT法檢測細胞存活率對數(shù)生長期人膀胱癌T24細胞調(diào)整細胞濃度為1×10<'5>個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后加入終濃度分別為0.01、0.1、1、10μg/ml的羥基喜樹堿，對照組加入等體積10％的1640培養(yǎng)液，每個濃度設6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT法檢測細胞存活率。 二、

4、TUNEL法人膀胱癌T24.細胞接種于蓋玻片上，設對照組和實驗組，實驗組采用1μg/ml羥基喜樹堿處理48小時。從六孔板內(nèi)取出蓋玻片后，按照試劑盒說明書操作，每個濃度重復3次，200倍光學顯微鏡下觀察。每張蓋玻片上隨機計數(shù)500個細胞，計數(shù)凋亡細胞數(shù)占細胞總數(shù)的比率，即凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，計算公式：AI(％)=(凋亡細胞數(shù)/500)×100％。 三、流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率對數(shù)生長期人膀胱

5、癌T24細胞調(diào)整細胞濃度為1×10<'5>個/ml，接種于25cm<'2>細胞培養(yǎng)瓶，24小時細胞80％左右融合，收集對照組和分別經(jīng)0.01、0.1、1、10μg/ml的羥基喜樹堿處理48 h的人膀胱癌T24細胞，PI單染后流式細胞儀下檢測。每個濃度重復3次，每次計數(shù)10<'4>個細胞。采用CELL QuEST軟件進行DNA含量分析，以G<,0>/G<,1>峰前出現(xiàn)的亞二倍體細胞數(shù)量占細胞總數(shù)的百分率表示凋亡率。 四、Wlest

6、ern Blot檢測Bcl-2蛋白含量變化收集對照組和羥基喜樹堿(1μg/ml)處理48 h的人膀胱癌T24細胞，提取細胞總蛋白。酚試劑法對提取的蛋白樣品進行定量。細胞總蛋白作Bcl-2蛋白含量分析。 每個樣本重復3遍。細胞總蛋白以β-actin作內(nèi)參照。采用Fluorchem v2.0凝膠成像分析軟件(美國Alpha公司)對條帶進行灰度掃描，以平均灰度和條帶面積的乘積代表信號強度，以目的條帶和內(nèi)參照灰度的比值表示蛋白含量。