地塞米松拮抗紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來紫杉醇聯(lián)合順鉑的化療方案(PT方案)已廣泛應(yīng)用于臨床治療卵巢癌,尤其是卵巢癌晚期無法手術(shù)的姑息治療、一線化療失敗或多次化療失敗的轉(zhuǎn)移性卵巢癌,為了防止化療時(shí)紫杉醇藥物發(fā)生嚴(yán)重的過敏及惡心嘔吐等反應(yīng),在接受化療前的所有患者應(yīng)事先進(jìn)行地塞米松預(yù)防用藥。但近來許多研究表明,地塞米松能選擇性抑制紫杉醇誘導(dǎo)一些腫瘤細(xì)胞的凋亡,下調(diào)機(jī)體的免疫反應(yīng),導(dǎo)致腫瘤組織轉(zhuǎn)移,影響紫杉醇在惡性腫瘤化療中的療效,那么地塞米松對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用

2、如何,是否拮抗紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡從而降低紫杉醇的療效?因此,本項(xiàng)目以人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3為材料,通過體外實(shí)驗(yàn)探討地塞米松預(yù)處理對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響、發(fā)生的可能機(jī)制,并建立SKOV-3裸鼠移植瘤,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討地塞米松對(duì)紫杉醇抗腫瘤療效的影響,對(duì)今后在臨床工作中如何正確認(rèn)識(shí)和使用地塞米松以及開發(fā)紫杉醇的給藥途徑必將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。 第一部分 地塞米松對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞凋

3、亡的保護(hù)作用 目的：探討地塞米松(Dex)對(duì)紫杉醇(PTX)抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響。 方法： (一)MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖 1、用含不同濃度紫杉醇(10 nM、20 nM、50 nM、100 nM)的培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞24小時(shí),測(cè)定紫杉醇對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖的影響。 2、用不同濃度地塞米松(0、0.001 uM、0.01 uM、0.1 uM、

4、1 uM)對(duì)SKOV-3細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理24h后,每組中分別再用含不同濃度的紫杉醇(0、10 nM、20 nM、50 nM、100nM)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24h,測(cè)定不同濃度的地塞米松對(duì)不同濃度的紫杉醇進(jìn)行預(yù)處理后對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖的影響。 (二)TUNEL聯(lián)合DAB染色從形態(tài)學(xué)觀察地塞米松對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響。 (三)PI單染法測(cè)定地塞米松對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞凋亡及細(xì)

5、胞周期的影響。 結(jié)果： (一)PTX能夠抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞增殖,且與PTX的濃度有關(guān),濃度越高,抑制率越大。 (二)0.001～1uM濃度范圍內(nèi)地塞米松對(duì)紫杉醇抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞增殖有不同程度的保護(hù)作用。 (三)TUNEL法聯(lián)合DAB染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,對(duì)照組中極少見到凋亡細(xì)胞,PTX組出現(xiàn)大量DAB染的胞核呈棕黃色的凋亡細(xì)胞,表現(xiàn)為核固縮,染色質(zhì)邊聚,凝集成塊,并可見散在

6、棕色的凋亡小體。但預(yù)先用地塞米松進(jìn)行處理后再用PTX處理組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞較單用紫杉醇明顯減少。凋亡指數(shù)(AI)在對(duì)照組和Dex組分別為3.5±0.25％和4.0±0.26％兩組間無差異,在Dex+PTX組與PTX組為11.7±1.72％和30.8±1.15％,兩組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01),且Dex+PTX組與PTX組比較,Dex+PTX組凋亡指數(shù)降低,有明顯差異(P<0.01)。 (四)PI單染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率表明地塞米

7、松進(jìn)行預(yù)處理后再用紫杉醇組細(xì)胞凋亡率為5.55±0.53％較單用紫杉醇組細(xì)胞凋亡率13.90±1.62％明顯降低(P<0.01),而且在地塞米松拮抗紫杉醇誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡中,用地塞米松預(yù)處理后再用紫杉醇組與單用紫杉醇組比較,細(xì)胞周期中G2/M期無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： (一)地塞米松對(duì)紫杉醇抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞增殖有保護(hù)作用,且與地塞米松的給藥濃度有關(guān)。 (二)地塞米松能拮抗紫杉

8、醇誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞凋亡,但與細(xì)胞周期中G2/M期停滯無關(guān)。 第二部分 地塞米松拮抗紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制 目的：從IAP家族中抗凋亡基因Survivin和Bcl-2家族中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL兩條通路,探討地塞米松拮抗紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制,并為下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：將細(xì)胞用不同藥物處理后,用半定量RT-P

9、CR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bcl-XL and Survivin mRNA的表達(dá)。Western blot檢測(cè)BcI-XL和末端半胱氨酸蛋白酶Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： (一)用地塞米松進(jìn)行預(yù)處理后再用紫杉醇組(Dex+PTX組)與單用紫杉醇組(PTX組)比較,Dex+PTX組BcI-XL mRNA、Survivin mRNA的表達(dá)明顯高于PTX組(P<0.01)。 (二)Bcl

10、-2蛋白家族成員Bcl-2 mRNA的表達(dá):Dex組和Dex+PTX組Bcl-2蛋白家族成員Bcl-2 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組無差異(P>0.05),Dex+PTX組與PTX組之間比較也無差異(P>0.05)。 (三)BcI-XL蛋白水平表達(dá):Dex組較對(duì)照組升高(p<0.01),而且用地塞米松進(jìn)行預(yù)處理后再用紫杉醇組(Dex+PTX組)與單用紫杉醇組(PTX組)比較,Dex+PTX組Bcl-XL蛋白表達(dá)明顯高于PTX組(P<0

11、.01)。 (四)Cleaved caspase-3蛋白水平表達(dá):Dex組和Dex+PTX組較對(duì)照組明顯降低(p<0.01),而且用地塞米松進(jìn)行預(yù)處理后再用紫杉醇組(Dex+PTX組)與單用紫杉醇組(PTX組)比較,Dex+PTX組Cleaved caspasc-3蛋白表達(dá)明顯低于PTX組(P<0.01)。 結(jié)論：地塞米松對(duì)紫杉醇的抗凋亡作用可能通過上調(diào)IAP家族中Survivin和Bcl-2家族中Bcl-XL抗凋亡基因

12、的表達(dá),下調(diào)caspase3活性,從而抑制人卵巢細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞凋亡。 第三部分 地塞米松在人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3裸鼠移植瘤中對(duì)紫杉醇抗腫瘤療效的影響 目的：通過建立人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3裸鼠移植瘤模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)地塞米松進(jìn)行預(yù)處理后,對(duì)紫杉醇抗腫瘤作用的影響,并進(jìn)一步分析其作用機(jī)理。 方法： (一)建立人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3裸鼠移植瘤的模型。 (二)分組及給藥：(1)對(duì)

13、照組：生理鹽水(含0.001％無水乙醇),腹腔內(nèi)注射；(2)地塞米松組：1mg/kg,腹腔內(nèi)注射；(3)紫杉醇組：20mg/kg,尾靜脈注射；(4)地塞米松+紫杉醇組：在其它三組給藥前12小時(shí),預(yù)先給予地塞米松1mg/kg,腹腔內(nèi)注射,然后給予紫杉醇20mg/kg,尾靜脈注射。三天一個(gè)療程共6個(gè)療程。 (三)觀察移植瘤的生長,繪制裸鼠移植瘤的生長曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)束稱瘤體的重量,計(jì)算腫瘤生長抑制率。 (四)免疫組化分析:Bcl

14、-XL和Cleaved caspasc-3蛋白的表達(dá),細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67的表達(dá)。 (五)光鏡和透射電鏡下觀察組織形態(tài)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果： (一)在紫杉醇對(duì)SKOV-3裸鼠移植治療中,用地塞米松進(jìn)行預(yù)處理后再用紫杉醇組,移植瘤的體積較單用紫杉醇組增大(P<0.01)。 (二)治療結(jié)束后稱瘤重,Dex+PTX治療組瘤重為0.79±0.09g,PTX組瘤重為0.50±0.08g,Dex+PTX組較

15、PTX組瘤重升高(P<0.01)。Dex+PTX組和PTX組抑制率分別為45.14％和65.28％,PTX組較Dex+PTX組抑制率大約增加18-25％。 (三)HE染色后,PTX治療組絕大部分細(xì)胞變大,細(xì)胞質(zhì)較其它組明顯減少,細(xì)胞表現(xiàn)為空泡和凋亡特征。在Dex+PTX組中也有一些細(xì)胞表現(xiàn)為空泡和凋亡特征,但明顯少于PTX組。電鏡下Dex+PTX組和PTX組可見核固縮,染色質(zhì)邊聚,凝集成塊等細(xì)胞凋亡征象,但Dex+PTX組中細(xì)胞

16、凋亡征象少于PTX組。 (四)免疫組化結(jié)果表明,Dex+PTX組與PTX組相比,在Dex+PTX組中Ki-67細(xì)胞增殖標(biāo)記物、BcI-XL蛋白表達(dá)升高,Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降低,有顯著性差異,P<0.0125。 結(jié)論： (一)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)地塞米松能降低紫杉醇對(duì)人卵巢癌SKOV-3裸鼠移植瘤治療效果。 (二)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)地塞米松能拮抗紫杉醇誘導(dǎo)的人卵巢癌SKOV-3裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡,