輻射后HepG2細(xì)胞IER5與Cdc25B啟動子的相互作用.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌是世界第五大惡性腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡原因中排名第三。目前，臨床上常用的治療原發(fā)性肝癌的方法有射頻消融治療、肝動脈栓塞化療、無水乙醇注射治療、放療等，但療效欠佳，這很大程度上歸因于肝癌的異質(zhì)性。放療是惡性腫瘤治療的主要手段之一，如何提高肝癌的輻射敏感性是提高肝癌放療療效的關(guān)鍵。因此人們一直致力于尋找肝癌的輻射敏感基因。IER5基因?qū)儆诼齽恿蚪M，電離輻射可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞IER5表達(dá)上調(diào)，我們的前期研究結(jié)果顯示:抑制IE

2、R5表達(dá)能促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞及宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其抗輻射能力，降低其輻射敏感性;增加IER5表達(dá)能抑制HepG2和Hela細(xì)胞生長、增殖與分裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，削弱其抗輻射能力，增強(qiáng)其輻射敏感性。說明IER5基因在肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤發(fā)生中發(fā)揮一定作用，IER5基因參與了肝癌及宮頸癌輻射敏感性的調(diào)節(jié)，作用類似于p53等抑癌基因。細(xì)胞周期(cell cycle)，是指能持續(xù)分裂的真核細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束后生長，再到下一次分

3、裂結(jié)束的循環(huán)過程。癌變的細(xì)胞以及特定階段的胚胎細(xì)胞常常有異常的分裂周期。Cdc25磷酸酶是一種雙特異磷酸酶，是細(xì)胞周期的重要調(diào)控元件。Cdc25磷酸酶有三個(gè)亞型:Cdc25A，Cdc25B和Cdc25C。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中Cdc25B表達(dá)增加，多數(shù)研究認(rèn)為Cdc25B過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。Cdc25B啟動子分析顯示p53通過與Cdc25B的啟動子相結(jié)合抑制Cdc25B表達(dá)，從而抑制了腫瘤的發(fā)生。目前國外研究發(fā)現(xiàn)在急性淋巴細(xì)胞白血

4、病細(xì)胞中IER5通過與Cdc25B啟動子相結(jié)合來抑制其表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。IER5在肝癌HepG2細(xì)胞中是否也通過與Cdc25B啟動子相結(jié)合來發(fā)揮其抑癌基因的作用，目前國內(nèi)外未見報(bào)道，本研究以HepG2細(xì)胞為研究對象，采用RT-PCR、半定量PCR、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、染色質(zhì)免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因等方法研究IER5與Cdc25B間的相互作用。進(jìn)一步探討IER5基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機(jī)制，期望為肝癌的分子靶向治療提供新的靶

5、點(diǎn)。
　　方法:1采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測4Gy Co60γ射線照射后HepG2細(xì)胞IER5及Cdc25B mRNA表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。2采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)降低HepG2細(xì)胞IER5表達(dá)，采用半定量PCR方法檢測Cdc25B mRNA含量，研究抑制IER5表達(dá)對4Gy Co60γ射線照射后Cdc25B mRNA表達(dá)的影響。3采用染色質(zhì)免疫共沉淀方法分別于4Gy Co60γ射線照射后0、2、4、6、8h，檢測HepG2細(xì)胞IER5蛋

6、白與Cdc25B啟動子結(jié)合的變化。4構(gòu)建Cdc25B啟動子重組質(zhì)粒，采用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析4Gy Co60γ射線照射后IER5對HepG2細(xì)胞Cdc25B啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1、輻射后HepG2細(xì)胞IER5和Cdc25B mRNA表達(dá)的變化:4Gy Co60γ射線照射后0、1、2、4、8、12h檢測HepG2細(xì)胞IER5及Cdc25B mRNA的含量，結(jié)果顯示:IER5 mRNA于照射后2h較未照射

7、時(shí)(0h)明顯增加，同時(shí)Cdc25B mRNA表達(dá)開始下降，照射后4h Cdc25B mRNA明顯低于未照射時(shí)，兩者間呈相反的變化趨勢，提示IER5可能存在抑制Cdc25B表達(dá)的作用。
　　2、抑制IER5表達(dá)對輻射調(diào)控Cdc25B mRNA表達(dá)的影響:4Gy Co60γ射線照射后，與對照HepG2細(xì)胞相比，IER5低表達(dá)細(xì)胞Cdc25B mRNA含量無明顯下降，說明抑制IER5表達(dá)削弱了輻射對Cdc25B表達(dá)的抑制作用，提示輻射

8、可能通過增加IER5的表達(dá)來抑制Cdc25B的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　3、輻射后HepG2細(xì)胞IER5蛋白與Cdc25B啟動子間的作用:4Gy Co60γ射線照射HepG2細(xì)胞后0、2、4、6、8h收集細(xì)胞，采用交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測IER5蛋白與Cdc25B啟動子結(jié)合的變化。結(jié)果顯示:輻射后4h IER5蛋白與Cdc25B啟動子結(jié)合顯著性增多，且隨著IER5表達(dá)增加二者結(jié)合進(jìn)一步增多，說明IER5通過競爭性結(jié)合Cdc2

9、5B啟動子發(fā)揮抑制Cdc25B表達(dá)的作用。
　　4、輻射后抑制IER5表達(dá)對Cdc25B啟動子活性的影響:應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因方法，構(gòu)建Cdc25B啟動子重組質(zhì)粒，分別包含靶啟動子片段(-911,+105)、(-575,+105)、(-227,+105)、(-122,+105)和(-51，+105)。將五種不同的Cdc25B啟動子重組質(zhì)粒與shIER5質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，IER5低表達(dá)細(xì)胞（轉(zhuǎn)染shIER5質(zhì)粒）

10、為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒者為對照組，4Gy Co60γ射線照射后檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示:照射前，分別轉(zhuǎn)染(-911，+105)、(-575，+105)、（-227，+105）、(-122，+105)四種啟動子片段的實(shí)驗(yàn)組較對照組Cdc25B啟動子轉(zhuǎn)錄活性明顯增加，而轉(zhuǎn)染（-51，+105）片段的實(shí)驗(yàn)組與對照組間啟動子活性無明顯差異，說明抑制IER5表達(dá)增加了Cdc25B啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，且(-51，+105)片段中未包含IER5的作用

11、位點(diǎn)，其作用位點(diǎn)可能在(-122，-51);照射后，分別轉(zhuǎn)染五種不同啟動子重組質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組與對照組間Cdc25B啟動子轉(zhuǎn)錄活性的無明顯差異，提示輻射上調(diào)IER5表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組與對照組啟動子轉(zhuǎn)錄活性的差異消失，再次說明IER5對Cdc25B啟動子的轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用。
　　結(jié)論:輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞IER5表達(dá)增加，IER5可能通過競爭性結(jié)合Cdc25B啟動子，抑制Cdc25B啟動子轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)Cdc25B表達(dá)，從而發(fā)揮其抑癌基