hTERT基因啟動子調(diào)控HSV-tk-GCV系統(tǒng)對HepG2細胞殺傷作用.pdf

1、目的：建立HSV-tK的相關(guān)真核表達載體，通過脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞后，研究人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因核心啟動子調(diào)控的人單純皰疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韋(HSV-tK/GCV)系統(tǒng)對肝癌細胞的體外殺傷作用。 方法：1.利用重組DNA技術(shù)，以pGL3-hTERT/tk為基礎(chǔ)，構(gòu)建pGL3-hTERT/luc、pGL3-basic/tk(陰性對照)、pGL3-control/tk(陽性對照)等真核表達載體，并轉(zhuǎn)入J

2、M109進行酶切鑒定；2.將序列正確的載體大量純化擴增后，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染肝癌細胞(HepG2)和正常肝細胞(L02)，然后用不同濃度的G418篩選陽性克隆細胞，提取陽性克隆細胞的RNA，并進行RT-PCR鑒定；3.用熒光顯微鏡檢測hTERT啟動子的活性；4.給予前藥更昔洛韋(GCV)，用原位末端標記(TUNEL)法、流式細胞儀檢測hTERT調(diào)控的HSV-tk/GCV系統(tǒng)對兩種細胞進行細胞凋亡和細胞周期分析；5.Western blot

3、檢測細胞周期素cyelinD1、CDK2、P21的蛋白表達。 結(jié)果：1.構(gòu)建的三組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ、Xba Ⅰ雙酶切后，所得基因片斷與預期基因片斷大小相符；2.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pGL3-hTERT/tk轉(zhuǎn)入HepG2細胞后，篩選出了抗高濃度(900μg/ml)G418的陽性克隆，并用RT-PCR法進行了鑒定；3.通過熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)：hTERT啟動子調(diào)控的luc基因可在腫瘤細胞中特異性表達，而SV40啟動子調(diào)控的則沒有腫瘤特異性

4、；4.給予前藥更昔洛韋(GCV)后，原位末端標記(TUNEL)法顯示，陰性對照組腫瘤細胞胞漿被染成藍色；而pGL3-hTERT/tk組細胞密度明顯變低，大部分細胞核被染成棕黃色；流式細胞儀檢測：pGL3-hTERT/tk(hepG2/tk)在HepG2細胞的凋亡率明顯高于pGL3-basic/tk組，但卻低于pGL3-control/tk組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而在正常肝細胞L02中，pGL3-control/tk凋亡率最

5、高，與前兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。從S期細胞所占總細胞比例來看，hepG2/tk細胞明顯少于對照細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示pGL3-Htert-tk/GCV系統(tǒng)對細胞DNA的合成和復制有影響：5.Western blot也顯示cyclinD1、CDK2蛋白表達下降而P21升高。 結(jié)論：成功構(gòu)建了TX的相關(guān)真核表達載體，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)入HepG2腫瘤細胞，可促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡、細胞周