rAAV2介導(dǎo)的HSV-TK-GCV系統(tǒng)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞抑制作用的研究.pdf

1、第一章腺相關(guān)病毒介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因在晶狀體上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達(dá) 目的：研究2型重組腺相關(guān)病毒(rAAV2)載體介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)在體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細(xì)胞(N/N1003A)67的表達(dá)，以及病毒載體轉(zhuǎn)染對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞增殖的影響，為rAAV2攜帶治療基因防治后囊膜混濁提供理論依據(jù)。 方法：rAAV2-EGFP按感染復(fù)數(shù)(MOI)為10<'4>、10<'5>、2×10<'6>、10<'6>轉(zhuǎn)染

2、N/N1003A細(xì)胞，相差顯微鏡觀察rAAV-EGFP轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)的影響；轉(zhuǎn)染后每天在倒置熒光顯微鏡下觀察晶狀體上皮細(xì)胞中EGFP的表達(dá)，于轉(zhuǎn)染后1、3、5、7、9d，記錄200個(gè)細(xì)胞中EGFP陽(yáng)性表達(dá)所占的百分比；當(dāng)EGFP表達(dá)穩(wěn)定后激光共聚焦顯微鏡照相。轉(zhuǎn)染后第2、7d流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAAV2-EGFP對(duì)N/N1003A細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。MTT比色法測(cè)定rAAV2-EGFP對(duì)N/N1003A細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)論：重組

3、腺相關(guān)病毒載體可以介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染晶狀體上皮細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)染效率高，腺相關(guān)病毒是后囊膜混濁基因治療的良好載體。 第二章攜帶HSV-TK基因的重組AAV載體的構(gòu)建及表達(dá) 目的：構(gòu)建含有單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pSNAV2.0-TK，制備重組腺相關(guān)病毒rAAV2/HSV-TK，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染TK基因后晶狀體上皮細(xì)胞細(xì)胞中的整合和表達(dá)，為后囊膜混濁的基因治療奠定基礎(chǔ)。

4、 方法：用SalI+EcoRI酶將TK基因從質(zhì)粒pDC316-TK切出，連接到質(zhì)粒pSNAV2.0中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pSNAV2.0-TK，分別甩PCR和上述內(nèi)切酶鑒定重組質(zhì)粒；以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，在G418壓力下篩選得到攜帶載體質(zhì)粒pSNAV2.0-TK的載體細(xì)胞株，并在輔助病毒HSV1-rc/△UL2的參與下包裝重組病毒rAAV2/HSV-TK； SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法和高效液相色譜(HPLC)法

5、檢測(cè)rAAV2/HSV-TK的純度；用DNA斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)純化的rAAV2/HSV-TK的滴度；重組病毒rAAV2/HSV-TK轉(zhuǎn)染N/N1003A細(xì)胞，用PCR和RT-PCR分別檢測(cè)TK基因的整合和表達(dá)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了攜帶TK基因的重組載體質(zhì)粒pSNAV2.0-TK，制備了高純度、高滴度的重組腺相關(guān)病毒rAAV2/HSV-TK；轉(zhuǎn)導(dǎo)重組病毒rAAV2/HSV-TK的晶狀體上皮細(xì)胞中有TK基因的整合和有效表達(dá)。 第

6、三章重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的作用 目的：觀察2型重組腺相關(guān)病毒(rAAV2)載體介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因/丙氧鳥(niǎo)苷(GCV)系統(tǒng)對(duì)體外培養(yǎng)兔晶狀體上皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，并初步探討晶狀體上皮細(xì)胞死亡的機(jī)制。 方法：利用攜帶HSV-TK基因的2型重組腺相關(guān)病毒(rAAV2)載體rAAV2/HSV-TK感染體外培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞N/N1003A，聯(lián)合使用GCV治療，以

7、沒(méi)有轉(zhuǎn)染重組病毒的細(xì)胞作為對(duì)照，MTT法觀察不同濃度GCV和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響；分別將轉(zhuǎn)染了HSV-TK基因的N/N1003A-TK細(xì)胞與正常N/N1003A細(xì)胞按不同比例混合培養(yǎng)，觀察HSV-TK/GCV系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)；以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的重組病毒rAAV2/HSV-TK轉(zhuǎn)染N/N1003A細(xì)胞，觀察MOI對(duì)HSV-TK/GCV系統(tǒng)殺傷效應(yīng)的影響。應(yīng)用透射電鏡觀察、Hoechst33258染色等方法觀察細(xì)胞凋亡、壞死改