2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的 骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種退行性骨關(guān)節(jié)病,滑膜的炎性增生反應(yīng)是關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞的重要參與者,促進(jìn)了OA的病程進(jìn)展。OA發(fā)生時滑膜增生,超微結(jié)構(gòu)觀察呈現(xiàn)功能活躍相。OA嚴(yán)重危害老年人健康,是長期喪失勞動力的重要原因之一。但至今對OA的治療效果和方便程度無法令人滿意?;蛑委烵A的研究也在進(jìn)行中,促進(jìn)了對OA的治療。本課題是利用自殺基因選擇性作用于增殖活躍細(xì)胞的機(jī)理,觀察腺病毒介導(dǎo)的單純皰疹病毒-胸苷激酶

2、(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)基因/丙氧鳥苷(ganciclovir,GCV)系統(tǒng)對OA增殖活躍的滑膜細(xì)胞的作用,初步研究其在OA基因治療中的應(yīng)用。 材料和方法 1、帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重組腺病毒于我院中心實驗室保存,重組腺病毒Ad CMV HSV-TK的擴(kuò)增、純化及滴度測定均由我院實驗室完成,Ad-

3、TK的病毒效價為1×10<'12>。 2、取OA患者行膝關(guān)節(jié)置換時切下的滑膜組織,按Goto方法分離并傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。取第三代滑膜細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板上,分別加入不同滴度的Ad-TK,第1孔加入PBS進(jìn)行空白對照,感染24h。熒光顯微鏡下計數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞百分率來測定細(xì)胞的感染效率,繪制感染效率曲線。 3、滑膜細(xì)胞接種于96孔板上,加入100moi的病毒液感染24h,以未感染的細(xì)胞作為對照。

4、分別加入不同濃度的GCV。48h后加入MTT,4h后測定各孔的吸光值(A)。計算細(xì)胞的生長抑制率=(1-實驗孔A值/對照孔A值)×100﹪。將感染100moi病毒的滑膜細(xì)胞按所占比例分別為20﹪、40﹪、60﹪、80﹪同未感染的細(xì)胞混合24 h接種于96孔板上,以未感染的細(xì)胞作為對照。加入10mg/l的GCV 48h。MTT法測吸光值計算細(xì)胞抑制率。 4、100 moi的Ad.TK感染滑膜細(xì)胞24h后,給予10mg/l GCV,

5、于0、12、24、48h分別置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化;100moi的Ad-TK感染滑膜細(xì)胞24h后,給予10mg/lGCV,48h后用Hoechst33342/PI染色、固定,將細(xì)胞懸液滴在載玻片上,加蓋玻片,用熒光顯微鏡觀察、計數(shù)。 5、100 moi的Ad-TK感染滑膜細(xì)胞24h后,給予10mg/lGCV48h后消化、離心、回收所有細(xì)胞,加入Annexin V-FITC、PI;流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。 結(jié)果

6、 1、滑膜細(xì)胞貼壁后,鏡下可見三種類型的細(xì)胞,即樹突樣細(xì)胞(DCs)、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞(MCs)和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(FCs),以FCs成分為主。當(dāng)培養(yǎng)到第三代時,形成較為均一的FCs。細(xì)胞呈梭形,增殖活躍。轉(zhuǎn)染腺病毒的滑膜細(xì)胞表達(dá)GFP;當(dāng)腺病毒濃度為100moi以上時,有100﹪的滑膜細(xì)胞感染。 2、MTT法測定滑膜細(xì)胞抑制率:細(xì)胞只加入Ad-TK或GCV,生長未受抑制;100moi Ad-TK轉(zhuǎn)染組細(xì)胞加入GCV后,細(xì)胞生長受

7、抑制,并隨GCV濃度增大細(xì)胞抑制率增大,當(dāng)加入10 mg/l GCV后,細(xì)胞抑制率為76.0﹪。將細(xì)胞混合培養(yǎng),加入10 mg/l GCV 48h后,當(dāng)感染細(xì)胞占20﹪時,細(xì)胞抑制率為對照組的31.2﹪;細(xì)胞抑制率高于不混合時的抑制率。 3、滑膜細(xì)胞經(jīng)HSV-TK/GCV系統(tǒng)作用后,倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形,胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡改變,細(xì)胞核變大;24h后細(xì)胞進(jìn)一步腫脹變大,胞漿內(nèi)空泡增多,細(xì)胞核變得模糊不清;48h后

8、部分細(xì)胞裂解為碎片。HSV-TK/GCv系統(tǒng)處理的滑膜細(xì)胞,用}toechst 33342/PI雙染色后有3種細(xì)胞狀態(tài),分別為:正常細(xì)胞藍(lán)色淡染,凋亡細(xì)胞為濃染或成顆粒狀,壞死細(xì)胞為紅色。 4、流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染TK基因并給予GCV后48 h,細(xì)胞出現(xiàn)較大比例的壞死和凋亡,壞死和凋亡比例分別為59.1﹪、13.4﹪,對照組無明顯壞死和凋亡。 結(jié)論: 1、OA滑膜細(xì)胞取材方便,易于體外培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增;攜帶GFP的腺

9、病毒載體可以高效感染體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞。 2、HSV-TK/GCV系統(tǒng)對體外OA滑膜細(xì)胞有抑制作用,在一定范圍內(nèi)GCV有濃度依賴性;HSV-TK/GCV系統(tǒng)對體外OA滑膜細(xì)胞存在"旁觀者效應(yīng)"。 3、細(xì)胞經(jīng)HSV-TK/GCV系統(tǒng)作用后形態(tài)學(xué)發(fā)生變化:細(xì)胞變形、結(jié)構(gòu)改變,最后死亡;雙染色后熒光顯微鏡見細(xì)胞有壞死和凋亡。 4、流式細(xì)胞儀證實HSV-TK/GCV系統(tǒng)對體外OA滑膜細(xì)胞有明顯抑制作用,壞死率高于凋亡率。

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