腺病毒介導的自殺基因HSV-TK-GCV系統(tǒng)對骨關節(jié)炎增殖滑膜細胞的作用的實驗研究.pdf

1、目的 骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性骨關節(jié)病，滑膜的炎性增生反應是關節(jié)結構破壞的重要參與者，促進了OA的病程進展。OA發(fā)生時滑膜增生，超微結構觀察呈現(xiàn)功能活躍相。OA嚴重危害老年人健康，是長期喪失勞動力的重要原因之一。但至今對OA的治療效果和方便程度無法令人滿意。基因治療OA的研究也在進行中，促進了對OA的治療。本課題是利用自殺基因選擇性作用于增殖活躍細胞的機理，觀察腺病毒介導的單純皰疹病毒-胸苷激酶

2、(herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)基因/丙氧鳥苷(ganciclovir,GCV)系統(tǒng)對OA增殖活躍的滑膜細胞的作用，初步研究其在OA基因治療中的應用。 材料和方法 1、帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重組腺病毒于我院中心實驗室保存，重組腺病毒Ad CMV HSV-TK的擴增、純化及滴度測定均由我院實驗室完成，Ad-

3、TK的病毒效價為1×10<'12>。 2、取OA患者行膝關節(jié)置換時切下的滑膜組織，按Goto方法分離并傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。取第三代滑膜細胞接種于24孔培養(yǎng)板上，分別加入不同滴度的Ad-TK，第1孔加入PBS進行空白對照，感染24h。熒光顯微鏡下計數(shù)表達GFP的細胞百分率來測定細胞的感染效率，繪制感染效率曲線。 3、滑膜細胞接種于96孔板上，加入100moi的病毒液感染24h，以未感染的細胞作為對照。

4、分別加入不同濃度的GCV。48h后加入MTT，4h后測定各孔的吸光值(A)。計算細胞的生長抑制率=(1-實驗孔A值/對照孔A值)×100﹪。將感染100moi病毒的滑膜細胞按所占比例分別為20﹪、40﹪、60﹪、80﹪同未感染的細胞混合24 h接種于96孔板上，以未感染的細胞作為對照。加入10mg/l的GCV 48h。MTT法測吸光值計算細胞抑制率。 4、100 moi的Ad．TK感染滑膜細胞24h后，給予10mg/l GCV，

5、于0、12、24、48h分別置倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；100moi的Ad-TK感染滑膜細胞24h后，給予10mg/lGCV，48h后用Hoechst33342/PI染色、固定，將細胞懸液滴在載玻片上，加蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察、計數(shù)。 5、100 moi的Ad-TK感染滑膜細胞24h后，給予10mg/lGCV48h后消化、離心、回收所有細胞，加入Annexin V-FITC、PI；流式細胞儀上機檢測。 結果

6、 1、滑膜細胞貼壁后，鏡下可見三種類型的細胞，即樹突樣細胞(DCs)、巨噬細胞樣細胞(MCs)和成纖維細胞樣細胞(FCs)，以FCs成分為主。當培養(yǎng)到第三代時，形成較為均一的FCs。細胞呈梭形，增殖活躍。轉染腺病毒的滑膜細胞表達GFP；當腺病毒濃度為100moi以上時，有100﹪的滑膜細胞感染。 2、MTT法測定滑膜細胞抑制率：細胞只加入Ad-TK或GCV，生長未受抑制；100moi Ad-TK轉染組細胞加入GCV后，細胞生長受

7、抑制，并隨GCV濃度增大細胞抑制率增大，當加入10 mg/l GCV后，細胞抑制率為76.0﹪。將細胞混合培養(yǎng)，加入10 mg/l GCV 48h后，當感染細胞占20﹪時，細胞抑制率為對照組的31.2﹪；細胞抑制率高于不混合時的抑制率。 3、滑膜細胞經(jīng)HSV-TK/GCV系統(tǒng)作用后，倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞由梭形轉變?yōu)閳A形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡改變，細胞核變大；24h后細胞進一步腫脹變大，胞漿內(nèi)空泡增多，細胞核變得模糊不清；48h后

8、部分細胞裂解為碎片。HSV-TK/GCv系統(tǒng)處理的滑膜細胞，用}toechst 33342/PI雙染色后有3種細胞狀態(tài)，分別為：正常細胞藍色淡染，凋亡細胞為濃染或成顆粒狀，壞死細胞為紅色。 4、流式細胞儀檢測轉染TK基因并給予GCV后48 h，細胞出現(xiàn)較大比例的壞死和凋亡，壞死和凋亡比例分別為59.1﹪、13.4﹪，對照組無明顯壞死和凋亡。 結論： 1、OA滑膜細胞取材方便，易于體外培養(yǎng)、傳代擴增；攜帶GFP的腺

9、病毒載體可以高效感染體外培養(yǎng)的滑膜細胞。 2、HSV-TK/GCV系統(tǒng)對體外OA滑膜細胞有抑制作用，在一定范圍內(nèi)GCV有濃度依賴性；HSV-TK/GCV系統(tǒng)對體外OA滑膜細胞存在"旁觀者效應"。 3、細胞經(jīng)HSV-TK/GCV系統(tǒng)作用后形態(tài)學發(fā)生變化：細胞變形、結構改變，最后死亡；雙染色后熒光顯微鏡見細胞有壞死和凋亡。 4、流式細胞儀證實HSV-TK/GCV系統(tǒng)對體外OA滑膜細胞有明顯抑制作用，壞死率高于凋亡率。