hTERT啟動子調控腺病毒介導的HSV-TK-GCV基因系統(tǒng)治療人膀胱癌的動物實驗研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤已經成為人類死亡的第一位或二位原因，而膀胱癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率最高的一種惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤發(fā)病率的第八位。膀胱癌最主要的特點就是容易復發(fā)，轉移機會也很高，對于大多數(shù)中晚期腫瘤，尤其伴有局部擴散或遠處轉移者，目前的治療方法還不能令人滿意，且浸潤性膀胱癌的治療一直是個難題。基因治療由于能針對腫瘤組織內特有的基因變異情況進行修復或促使腫瘤細胞死亡，具有廣闊的應用前景；特別是隨著一些高效而具有組織或細胞選擇性的給藥載體的成

2、功構建、一些新的更具殺傷力的目的基因的發(fā)現(xiàn)，使基因治療可能在21世紀成為繼外科手術和放療、化療腫瘤治療的第四大常規(guī)手段。單純皰疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase，HSV-tk)基因其表達產物胸苷激酶能在靶細胞中將一般臨床的抗病毒藥物，如環(huán)氧鳥苷(gancyclovir,GCV)轉化成三磷酸產物，干擾靶細胞的DNA的合成過程，導致細胞死亡，而載體腺病毒(adenovirus，Ad)因具有轉

3、移率高、宿主廣泛的優(yōu)點尤其適合腫瘤基因治療。端粒酶是目前所見到的特異性較好的一種廣泛的腫瘤新標志物。在90％以上的膀胱癌細胞中可檢測到其活性，而在絕大多數(shù)正常細胞無活性，這源于其核心成分——人端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasetranscriptase，hTERT)基因的轉錄激活，它的表達調控在轉錄水平上，從而可以增強基因治療的靶向性和安全性。利用hTERT啟動子來調控病毒攜帶的目的基因，理論上可使病毒選擇性在端粒酶陽性的腫

4、瘤細胞中表達目的基因。我們擬采用hTERT啟動子調控腺病毒介導的HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)，結合先天性缺乏胸腺的BALB/C裸鼠建立的人膀胱癌動物模型，給予重組腺病毒尾靜脈注射治療，觀察其在體內的治療效果、靶向性及安全性。 方法：裸鼠膀胱癌模型的建立和分組：在小鼠右前肢腋窩皮下接種253J膀胱癌細胞懸液，觀察小鼠腫瘤生長情況。當腫瘤生長至直徑約為6mm時，對荷瘤裸鼠進行隨機分組，選用瘤體大小一致的裸鼠28只，分為4組，每組

5、7只。A組為Ad-hTERT-HSV-TK/GCV組；B組為Ad-hTERT-HSV-TK組；C組為GCV組；D組為對照組。Ad-hTERT-HSV-TK經尾靜脈注射荷瘤小鼠，GCV腹腔注射治療。Ad-hTERT-HSV-TK/GCV治療后，觀察腫瘤體積、瘤重、腫瘤抑制率、腫瘤體積-時間曲線以及裸鼠生存期。通過常規(guī)病理切片觀察腫瘤破壞情況；通過TUNEL法、流式細胞學及透射電鏡進一步觀察腫瘤的凋亡情況，免疫組化染色檢測增殖細胞核抗原(P

6、CNA)，測定增殖指數(shù)。 結果：Ad-hTERT-HSV-TK/GCV治療組腹腔注射GCV后第7d，平均體積為286.43mm3±103.92mm3，明顯小于對照組499.77mm3±101.09mm3(p＜0.05)。直至實驗結束，腫瘤體積都明顯小于Ad-hTERT-HSV-TK、GCV治療組和對照組。說明腫瘤生長速度明顯慢于對照組及Ad-hTERT-HSV-TK、GCV治療組。從移植瘤抑制率曲線可以看出，Ad-hTERT-H

7、SV-TK/GCV組比Ad-hTERT-HSV-TK、GCV單獨治療組能夠更明顯的抑制腫瘤生長，進一步說明了Ad-hTERT-HSV-TK/GCV對腫瘤生長有明顯的抑制作用；對切除腫瘤標本的重量進行比較，可發(fā)現(xiàn)Ad-hTERT-HSV-TK/GCV組的移植瘤重量明顯輕于對照組(P=0.0001＜0.05)，也輕于Ad-hTERT-HSV-TK、GCV治療組(P＜0.05)；Ad-hTERT-HSV-TK/GCV治療組與Ad-hTERT-

8、HSV-TK、GCV治療組及對照組相比，可以明顯延長荷瘤小鼠的生存期。病理檢查發(fā)現(xiàn)，治療組腫瘤細胞呈稀疏分散排列，有片狀壞死，腫瘤血管明顯減少，組織結構紊亂，多為纖維組織所代替，部分胞漿空泡性變，胞漿淡染，染色質疏松，部分腫瘤細胞核固縮，呈退化表現(xiàn)。Ad-hTERT-HSV-TK/GCV治療后，心、肺、肝、腦、腎、脾組織形態(tài)學觀察，與正常對照形態(tài)學上無顯著區(qū)別。流式細胞技術及TUNEL法測定該系統(tǒng)所致的凋亡率明顯高于對照組(P＜0.05

9、)，透射電鏡檢查可明顯檢測到腫瘤細胞凋亡，另外通過免疫組化法測定核增值抗原所得的增殖指數(shù)可以看出Ad-hTERT-HSV-TK/GCV組明顯低于對照組(P＜0.05)。 結論：Ad-hTERT-HSV-TK/GCV系統(tǒng)對裸鼠移植瘤的生長有明顯抑制作用；向膀胱癌細胞選擇性地導入以hTERT作為啟動子腺病毒載體介導的HSV-TK基因增加了腫瘤細胞對GCV的敏感性，使HSV-TK基因準確導入腫瘤細胞，不侵犯正常細胞，從而增加治療的靶向