雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-tk-GCV治療大鼠膀胱癌分子機制研究.pdf

1、膀胱癌（bladder cancer）是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，同時也是全身十大常見腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類健康。手術(shù)是治療膀胱癌的主要手段，同時并輔以放化療以及生物治療，但復(fù)發(fā)率高，總體生存率仍不理想。因而，在最新的分子生物學(xué)研究成果基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研發(fā)有效的膀胱癌治療方法，具有重大的理論和現(xiàn)實意義。當(dāng)前，基因治療仍舊占據(jù)著腫瘤研究的前沿陣地，其中自殺基因療法是近年來腫瘤基因治療研究的主力軍，單純皰疹病毒胸苷激酶基因(herpes

2、 simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)/丙氧鳥苷(ganciclovir, GCV)作為目前研究最早最徹底并且最有效的自殺基因系統(tǒng)之一，在腫瘤基因治療中扮演著不可或缺的角色。就腫瘤基因治療的載體系統(tǒng)而言，目前主要有病毒載體和非病毒載體（脂質(zhì)體等），病毒載體本身有很多局限性，如病毒滴度低、宿主范圍有限、插入宿主基因組可能引起突變及病毒本身缺乏安全性等缺點，脂質(zhì)體等非病毒載體，普遍存在基因轉(zhuǎn)染效率低

3、、缺乏腫瘤特異靶向性等缺點，而雙歧桿菌作為一種具有良好腫瘤靶向定植性的厭氧細(xì)菌很好的克服以往腫瘤基因治療中缺乏腫瘤組織靶向性、安全性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低等“瓶頸”。
　　前期實驗中，我們采用雙歧桿菌介導(dǎo)的HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌，發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤體積縮小、重量減輕，腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加。本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上，對雙歧桿菌介導(dǎo)的HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌組織進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，尋求該治療系統(tǒng)的作用靶標(biāo)，并剖析靶標(biāo)

4、的功能，探索用雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌的分子機制。本論文分為二個部分。
　　第一部分雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠胱腫瘤的蛋白學(xué)研究
　　研究目的：應(yīng)用 iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-TK/GCV治療大鼠膀胱癌的差異表達(dá)蛋白，從整體水平上揭示該治療系統(tǒng)的作用機制，并篩選關(guān)鍵靶蛋白。
　　方法:
　　1.運用N－甲基亞硝基脲（MNU）膀胱灌注法建立大鼠膀胱腫

5、瘤原位模型，誘導(dǎo)結(jié)束后經(jīng)B超檢查和病理切片判斷是否建模成功。
　　2.然后將建模成功的60只 SD大鼠隨機分為4組：雙歧桿菌/PGEX-5X-1空質(zhì)粒對照組（BI/PGEX-1）、雙歧桿菌/PGEX-tk重組質(zhì)粒實驗組（BI-TK）、雙歧桿菌對照組（BI）和生理鹽水對照組（normal saline），每組15只，分別經(jīng)大鼠尾靜脈注射攜帶空質(zhì)粒、重組質(zhì)粒和未攜帶任何基因的雙歧桿菌菌液1ml（含嬰兒雙歧桿菌4.4×109個）以及生理

6、鹽水，每周給藥1次，共4次。每只SD大鼠每天腹腔注射GCV（50mg/kg），共4周。
　　3.分別取各組中部分大鼠膀胱癌組織包埋于石蠟中用于后續(xù)免疫組化檢測，提取各組膀胱癌總蛋白，依照說明書分別標(biāo)記肽段，114標(biāo)記生理鹽水對照組，115標(biāo)記BI-TK組，116標(biāo)記BI/PGEX-1組，117標(biāo)記BI組。MALDI-TOF/TOF進(jìn)行質(zhì)譜分析。
　　4.差異蛋白質(zhì)分析：利用ProteinPilot軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用IPI

7、rat protein database v3.49軟件搜索與質(zhì)譜匹配的蛋白。采用 PANTHER classification system( http://www.pantherdb.org)對差異蛋白進(jìn)行GO分析，運用IPA( http://www.ingenuity.com)對差異蛋白的信號通路進(jìn)行分析。
　　5.驗證差異蛋白的表達(dá)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡方法(Western blot)和免疫組化技術(shù)檢測各組膀胱癌組織中差異蛋

8、白表達(dá)情況，從而驗證蛋白組學(xué)研究的可靠性。
　　結(jié)果:
　　1. MNU膀胱灌注法建立膀胱癌模型過程中，有7只大鼠因麻醉過量死亡，有5只不明原因死亡，最后剩余63只。經(jīng)B超檢查均發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)新生物出現(xiàn)，隨機抽取3只大鼠取膀胱內(nèi)新生物病理檢查證實為膀胱癌，余下60只大鼠隨機分為4組。
　　2.質(zhì)譜分析結(jié)果:實驗共鑒定出膀胱癌差異蛋白402個,其中經(jīng)過治療系統(tǒng)處理后有192個蛋白表達(dá)下調(diào)，210個蛋白表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步通過生物

9、信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，Peroxiredoxin-I(Prx-I)與NF-κB信號通路聯(lián)系緊密，并且經(jīng)過上述治療系統(tǒng)處理后Prx-I表達(dá)明顯下調(diào)，加之我們前期實驗發(fā)現(xiàn)該治療系統(tǒng)能使激活型的Caspase3表達(dá)增加，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加，因而Prx-I可能參與到該治療系統(tǒng)的機制當(dāng)中。
　　3.差異蛋白的功能分析：根據(jù)生物信息功能注釋，差異蛋白主要參與代謝過程(26.9％)、細(xì)胞過程(13.6%)和細(xì)胞通訊過程(20.0%)3種生物過程

10、。根據(jù)分子功能注釋，差異蛋白主要執(zhí)行催化功能(36.8%)、結(jié)合功能(28.4%)和結(jié)構(gòu)性分子功能(15.1%)3種生物功能。根據(jù)蛋白種類注釋，主要包含氧化還原酶(9.8%)、細(xì)胞骨架蛋白(8.9%)、轉(zhuǎn)移酶(7.1%)、核酸結(jié)合蛋白(6.8%)及酶調(diào)節(jié)劑(6.2%)5部分。
　　4. Western Blot檢測 Prx-I的蛋白表達(dá)：與其他三組對比，BI-TK組中 Prx-I蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.001）。Westem

11、-blot結(jié)果與iTRAQ研究結(jié)果一致。
　　5.免疫組化檢測Prx-I在膀胱癌組織的表達(dá)情況。經(jīng)過該治療系統(tǒng)處理后的大鼠膀胱癌組織中，Prx-I的表達(dá)明顯降低，表達(dá)降低具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。免疫組化結(jié)果與 iTRAQ和 Western Blot結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.蛋白組學(xué)的新技術(shù)iTRAQ具有精確的定量效果，而且具有較好的重復(fù)性，能夠更好地了解雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-TK/GCV自殺基因治療

12、系統(tǒng)的相關(guān)分子機制，并且尋找到該治療過程中表達(dá)的關(guān)鍵蛋白及信號通路。
　　2. iTRAQ分析并鑒定出治療前后的大鼠膀胱癌組織中差異表達(dá)蛋白402個，其中有192個蛋白表達(dá)下調(diào)，210個蛋白表達(dá)下調(diào)。通過生物信息學(xué)分析，Prx-I與NF-κB信號通路聯(lián)系緊密，加之前期實驗結(jié)果，我們推測雙歧桿菌介導(dǎo) HSV- TK/GCV自殺基因治療系統(tǒng)是通過下調(diào)Prx-I表達(dá)然后作用于NF-κB信號通路增加膀胱癌的凋亡從而達(dá)到治療效果。
　

13、　3. Western Blot和免疫組化實驗結(jié)果與iTRAQ分析結(jié)果一致，均證實治療后Prx-I蛋白在大鼠膀胱癌組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)，這一方面驗證了iTRAQ技術(shù)的可靠性，另一方面為進(jìn)一步研究雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-TK/GCV自殺基因治療系統(tǒng)的作用機制提供了關(guān)鍵的候選靶點。
　　第二部分 Prx-I在膀胱癌細(xì)胞中的作用及機制研究
　　研究目的:
　　1.構(gòu)建Prx-I干擾質(zhì)粒shRNA轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株T24，觀察對膀

14、胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　2.研究Prx-I與NF-κB信號通路的關(guān)系。
　　方法:
　　1.構(gòu)建3條針對Prx-I的干擾shRNA序列以及無關(guān)序列作為陰性對照，通過實時定量PCR（qPCR）和Western Blot篩選最適干擾序列。
　　2. CCK8檢測沉默Prx-I基因表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞T24的細(xì)胞增值能力。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測沉默 Prx-I基因表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞 T24的凋亡與細(xì)胞周期情況

15、。
　　4.利用Western Blot檢測沉默Prx-I基因表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞核內(nèi)phospho-NF-κB p50和p65表達(dá)，以反映NF-κB信號通路的活化情況。
　　結(jié)果:
　　1.抑制膀胱癌細(xì)胞 T24中 Prx-I表達(dá)能抑制其增值能力，與無關(guān)序列組（4.51±0.73%）和空白對照組（4.96±0.46%）凋亡率相比，干擾組（21.99±1.10%）凋亡率明顯升高（P＜0.001），并且 G0/G1

16、期所占比例，干擾組（61.13±.50%）遠(yuǎn)高于無關(guān)序列組（49.62±0.84%）和空白對照組（48.03±1.17%），故抑制膀胱癌細(xì)胞T24中Prx-I表達(dá)能阻滯膀胱癌細(xì)胞周期于G0/G1期（P＜0.05）。
　　2.抑制 Prx-I表達(dá)后膀胱癌細(xì)胞 T24胞核內(nèi) phospho-NF-κB p50 and p65表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　1.抑制 Prx-I基因表達(dá)后可見膀胱癌細(xì)胞 T24增值能力下降，并且凋