MUC4在膀胱癌中的表達(dá)及其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)HSV--tk腺病毒靶向殺傷膀胱癌細(xì)胞的研究.pdf

1、膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中移行細(xì)胞癌占膀胱癌90％以上。膀胱癌的發(fā)生進(jìn)展是復(fù)雜的、多因素、多步驟的病理變化過(guò)程，既有內(nèi)在的遺傳因素，又有外在的環(huán)境因素，具有異源性、多中心、易復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)后惡性度增加的特點(diǎn)。目前大多數(shù)膀胱癌病因?qū)W研究集中于基因的改變。正常膀胱細(xì)胞惡變始于細(xì)胞DNA的改變，原癌基因突變后變?yōu)榘┗蚝?，使?xì)胞無(wú)節(jié)制的分裂，導(dǎo)致膀胱癌復(fù)發(fā)和進(jìn)展。膀胱癌發(fā)生的另一個(gè)重要分子機(jī)制是編碼調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA修復(fù)或

2、凋亡的蛋白抑癌基因失活，使DNA受損的細(xì)胞不發(fā)生凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控。此外，某些編碼生長(zhǎng)因子或其受體的正常基因的擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)，也與膀胱癌的發(fā)生進(jìn)展相關(guān)。
　　目前膀胱癌治療以手術(shù)為主，輔以術(shù)后膀胱灌注化療，但術(shù)后高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，研究膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等分子機(jī)制，對(duì)探尋膀胱癌真正理想治療措施將具有十分重要意義。目前研究表明，膀胱癌的復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移由腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)行為決定，其中腫瘤細(xì)胞的粘附能

3、力在腫瘤的復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移進(jìn)展中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)黏蛋白(mucin，MUC)與多種腫瘤的復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。MUC4是黏蛋白家族中的重要一員，研究發(fā)現(xiàn)其具有潛在癌基因特性，可作為部分腫瘤發(fā)展進(jìn)程中的標(biāo)記物。目前研究表明，MUC4在胰腺癌、卵巢癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)，可作為它們發(fā)展進(jìn)程中的標(biāo)記物。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)MUC4可通過(guò)多種機(jī)制參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，如細(xì)胞間粘附、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡

4、等。
　　近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MUC1與泌尿生殖腫瘤密切相關(guān)。運(yùn)用單克隆抗體檢測(cè)膀胱癌組織，發(fā)現(xiàn)癌組織樣本中MUC1表達(dá)率較非癌組織明顯增高，證實(shí)MUC1在膀胱癌組織中異常高表達(dá)，可能是膀胱惡性演進(jìn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。同時(shí)還有MUC1基因在前列腺癌和腎癌中均存在異常表達(dá)，且腎癌中其表達(dá)高低與其轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的研究報(bào)道。MUC1基因與泌尿生殖腫瘤，特別是與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，我們課題組在前期應(yīng)用二代基因測(cè)序技術(shù)對(duì)膀胱腫瘤外顯子捕

5、獲的研究中發(fā)現(xiàn):MUC4基因在膀胱腫瘤組織中高表達(dá)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于MUC4基因在膀胱癌中的研究極少，而同為黏蛋白家族的重要成員MUC4是否與膀胱癌密切相關(guān)？因此，本課題進(jìn)行了以下兩部分的實(shí)驗(yàn)研究。
　　第一部分:膀胱癌細(xì)胞株及膀胱癌組織中MUC4基因的表達(dá)
　　目的:探討MUC4基因在HT1376、T24膀胱癌細(xì)胞株、膀胱癌組織、癌旁組織及正常膀胱粘膜組織中的表達(dá)情況。
　　方法:運(yùn)用熒光定量PCR(QT-PCR)和W

6、estern blot方法檢測(cè)HT1376、T24兩種膀胱癌細(xì)胞株及正常膀胱粘膜上皮細(xì)胞株中MUC4基因mRNA與蛋白的表達(dá)。應(yīng)用QT-PCR檢測(cè)9對(duì)匹配的膀胱癌、癌旁組織及正常膀胱粘膜組織，共27例標(biāo)本中MUC4mRNA的表達(dá)，其中膀胱癌組織均為移行細(xì)胞癌，病理證實(shí)淺表性6例，浸潤(rùn)性3例。應(yīng)用免疫組化檢測(cè)64例膀胱組織（癌組織34例，癌旁組織20例，正常組織10例）中MUC4蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:通過(guò)QT-PCR檢測(cè)MUC4

7、的mRNA表達(dá):在HT1376、T24細(xì)胞株及正常膀胱粘膜上皮細(xì)胞株中其相對(duì)表達(dá)量分別為13.746±0.309、3.501±0.286、0.914±0.100;在9對(duì)匹配組織中，其在癌、癌旁及正常膀胱粘膜中相對(duì)表達(dá)量分別為10.673±2.797、2.679±0.488、0.610±0.294。與正常膀胱粘膜相比，MUC4的mRNA在膀胱癌細(xì)胞株及膀胱癌組織中呈高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與癌旁組織相比，MUC4 mR

8、NA在膀胱癌組織中表達(dá)量高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其在癌旁組織中表達(dá)高于正常膀胱粘膜，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通過(guò)Western blotting檢測(cè)，MUC4蛋白在HT1376、T24膀胱癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)，在HT1376細(xì)胞中表達(dá)量高于T24細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。34例膀胱癌組織中，免疫組化檢測(cè)顯示MUC4蛋白陽(yáng)性表達(dá)27例，陽(yáng)性率為79.4％;20例癌旁組織中MUC4陽(yáng)性表達(dá)

9、10例，陽(yáng)性率為50.0％;10例正常組織中MUC4陽(yáng)性表達(dá)3例，陽(yáng)性率30.0％，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);癌旁組織和正常組織中MUC4蛋白表達(dá)的結(jié)果與mRNA的表達(dá)情況相似。MUC4蛋白表達(dá)與膀胱癌臨床分期無(wú)關(guān)，與膀胱癌病理分級(jí)相關(guān)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:MUC4基因在HT1376、T24膀胱癌細(xì)胞株、膀胱癌組織中呈高表達(dá);初步認(rèn)為MUC4蛋白表達(dá)程度與膀胱癌病理分級(jí)相關(guān)，提示MUC4基因可能作為高級(jí)別膀胱癌

10、的候選靶基因，在膀胱癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分: MUC4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)HSV-tk腺病毒對(duì)膀胱癌細(xì)胞靶向殺傷作用
　　目的:探討MUC4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)HSV-tk腺病毒靶向殺傷膀胱癌細(xì)胞并引起細(xì)胞的凋亡。
　　方法:克隆MUC4啟動(dòng)子活性序列，利用重組熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)其在HT-1376和T24兩種膀胱癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性，以腺病毒系統(tǒng)為載體，構(gòu)建MUC4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的HSV-tk重組腺病毒，激活MUC4啟動(dòng)子信號(hào)

11、調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性，驅(qū)動(dòng)下游HSV-tk基因，與GCV聯(lián)合，檢測(cè)其對(duì)上述兩種膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　結(jié)果:通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)MUC4基因ATG上游啟動(dòng)子區(qū)域的重組腺病毒質(zhì)粒，在HT-1376和T24膀胱癌細(xì)胞中具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，而在對(duì)照組HFL1肺成纖維細(xì)胞中幾乎無(wú)轉(zhuǎn)錄活性，提示MUC4啟動(dòng)子對(duì)其下游HSV-tk基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有腫瘤細(xì)胞特異性。本研究結(jié)果表明MUC4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的HSV-tk重組腺病毒與GCV聯(lián)合能夠誘導(dǎo)HT-